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FtsH蛋白酶是一种兼具ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侣活性的兼职蛋白,在生物体内具有重要功能。原核生物中的FtsH蛋白酶多为胁迫诱导型;在高等植物中,FtsH蛋白酶与光胁迫、低温以及病害等密切相关,但对其确切的作用机制尚不清楚。己在多种原核生物中发现热诱导的ftsH基因,而在高等植物中尚未见热诱导ftsH的报道。为此,我们构建了热诱导的番茄cDNA文库,通过EST分析从中分离出全长的ftsH基因,将其命名为LeftsH6。对其表达特性研究充分证明其热诱导表达特性;在此基础上,用反向PCR法克隆了该基因的启动子,通过凝胶阻滞和GUS表达分析研究该基因的表达调控特征。另外,我们构建了LeftsH6基因的过量、胞质定位(无前导序列的LeftsH6 cDNA)和反义的真核表达载体并转化番茄,获得了各种转基因株系,以确定番茄热诱导型FtsH的生理功能。主要实验结果如下:1.从热诱导的番茄cDNA文库中分离到全长ftsH基因并进行了特征分析。该基因序列全长2213 bp(注册号:AB217916),包括一个2019 bp的读码框,推测的蛋白前体定位到叶绿体中,序列中存在AAA结构域和Zn2+结合结构域等已知的金属蛋白酶FtsH家族的特征结构域。在已克隆的基因中,该FtsH与拟南芥AtFtsH6最近源,被命名为LeftsH6。利用农杆菌侵染的方法将含有LeftsH6信号肽编码序列和gfp的融合基因转化烟草,GFP荧光表达分析发现:GFP在烟草表皮细胞的叶绿体中表达,证实LeftsH6基因具有叶绿体定位的特性。体外蛋白酶活性分析表明,纯化的FtsH具有蛋白水解活性,能降解酪蛋白但不降解BSA;突变的FtsH(Zn2+结合结构域中的谷氨酸Glu472突变为谷氨酰胺Gln)失去了体外蛋白酶活性。Southern杂交结果表明,该基因在番茄基因组中是单拷贝;Northern和Western杂交均表明该基因表达被热诱导,但其表达不被低温、干旱、盐胁迫、高光等胁迫调节。本研究首次证明了高等植物中存在热诱导的ftsH基因。2.用反向PCR法从番茄基因组中克隆了LeftsH6基因翻译起始位点上游1558 bp的启动子序列(注册号:AB218274),序列分析表明该启动子中除含有典型的TATA盒和CAAT盒之外,还含有几组比较典型的热激元件(HSE)。利用原核诱导表达的热激转录因子HsfA2和放射性标记的ftsH启动子片段(包含HSE)进行凝胶阻滞实验,证实LeftsH6启动子中的HSE具有与热激转录因子特异结合的能力。将LeftsH6启动子1558 bp、587 bp和332 bp的片段与gus报告基因融合构建真核表达载体(pF1558、pF587、pF332),转化烟草。对pF1558转基因烟草GUS活性检测