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变应性哮喘是一种与免疫相关的复杂疾病，受遗传和环境等多种因素的共同影响而发病。个体的遗传因素在哮喘发病中起着十分重要的作用。应用全基因组扫描或定位克隆技术已发现多个染色体区域与哮喘连锁。其中以5q31-33区最受研究者的关注，因为该区域包含众多细胞因子的基因以及一些与免疫相关的基因，且在多个人群的关联研究中重复表现与哮喘高度的连锁。越来越多的研究表明TH1／TH2细胞及其分泌的细胞因子的失衡与哮喘的发病相关。最近研究显示表达在T细胞表面的Tims基因家族蛋白在调节TH1和TH2细胞介导的免疫应答中起重要的作用。在人类，Tim-1和Tim-3是Tims基因家族重要的两个成员，它们均位于与哮喘高度连锁的染色体5q31-33区域。Tim-1主要表达在TH2细胞表面，调节TH2细胞的免疫应答。而Tim-3主要表达在TH1细胞表面，对TH1细胞起负性免疫调节作用。基于Tim-1和Tim-3在TH1／TH2免疫调节中重要的功能，Tim-1和Tim-3基因已成为哮喘重要的易感候选基因。针对Tim-1和死Tim-3多态性与哮喘的关联研究虽已在多个人群中开展，但受多种因素的影响，这些研究的结果未能得到统一和重复。对Tim-1与Tim-3基因多态性与哮喘的关系，仍需进一步研究。本研究我们首先探讨了Tim-1与Tim-3基因的表达与变应性哮喘的关系，然后采用基于家系和单体型的关联研究方法，应用TDT和HRR检验来分析Tim-1和Tim-3基因的多态性及单体型与中国湖北地区变应性哮喘及相关表型的相关性。研究分为3个部分。第一部分Tim-1及Tim-3在变应性哮喘患者PBMC中的表达目的：探讨Tim-1和Tim-3 mRNA在变应性哮喘患者外周血单个核细胞的表达水平，为进一步阐明Tims基因与哮喘的关系奠定基础。方法：随机收集的尘螨过敏性哮喘患者，共计12例，哮喘诊断全部符合2003年中华医学会呼吸学分会哮喘学组制定的标准。同时选取性别和年龄匹配的健康体检者12例作为对照。实验分3组，分别为哮喘组，尘螨刺激组和正常对照组。Ficoll分离PBMC后，取24孔培养板，哮喘组和尘螨刺激组每孔分别加入106个病人分离的PBMC，正常对照组加入106个健康体检者的PBMC，对尘螨刺激组再加入终浓度为20μg／m1的尘螨抗原。然后置37℃5％CO2培养箱中培养72 h，收集细胞，抽提总RNA。参照文献Tim-1、Tim-3引物序列，合成引物，采用实时荧光定量RT-PCR检测3组Tim-1和Tim-3的mRNA表达。结果：1．Tim-1 mRNA在尘螨过敏性哮喘患者外周血PBMC中相对表达值为0．27±0．09，显著高于健康对照组的0．13±0．03（P＜0．05）；患者PBMC在终浓度为20μg／m1的尘螨抗原刺激后，Tim-1表达明显升高，达0．59±0．22，与对照组和未刺激的哮喘组相比有显著差异（P＜0．01）；2．Tim-3 mRNA在哮喘患者外周血PBMC中相对表达值为0．39±0．09，明显高于健康对照组的0．18±0．06，差异有显著性（P＜0．05），同样患者PBMC在尘螨抗原刺激后，Tim-3 mRNA的表达也出现明显的升高，达0．66±0．22，与对照组和未刺激组相比差异均有显著性（P＜0．01）；结论：Tim-1和Tim-3 mRNA在尘螨变应性哮喘患者中表达明显升高，Tim-1和Tim-3可能参与人类变应性哮喘的发生和发展。第二部分Tim-3基因多态性及其与变应性哮喘易感性的关系第一节Tim-3基因序列的测定及其多态性的确定目的：探讨湖北地区汉族人群Tim-3基因启动子区和编码区的多态性及其构成的单体型特征，为后续基于Tim-3基因多态性与相关疾病的关联研究奠定基础。方法：选取湖北地区30例正常汉族人和30例变应性哮喘患者作为研究对象。采用分段PCR扩增直接测序法检测这60名研究对象Tim-3基因的启动子区、全部的外显子区及部分内含子区的多态性变异。将测序结果与NCBI及HapMap数据库进行对比，确定湖北汉族人群Tim-3基因多态性的分布特征。采用Pearsonχ2检验或Fisher’s确切概率法比较各位点的基因型和等位基因的频率在哮喘组和正常人组的分布。采用Haploview软件对各位点进行LD分析、单体型的构建和tSNPs的筛选。结果：1．Tim-3基因区域共检出13个多态位点，其中有5个为新发现的位点。各位点基因型和等位基因频率在30例正常组和30例哮喘组中未见明显的统计学差异（P＞0．05）。2．经与HapMap数据库比较，4个位点rs4704853、rs10515746、rs4704846、rs9313439等位基因的频率在湖北汉族人和北方汉族及日本人中的分布差异无统计学意义（P＞0．05），而与欧洲人及非洲人的分布有明显的不同（P＜0．01）。3．对7个频率大于5％的SNPs进行两两配对的LD分析显示其中6个位点之间呈现较强的连锁不平衡（D′和r2均大于0．3）。单体型分析共发现有5种频率大于1％的常见单体型。4．在该单体型域中选出3个tSNPs：rs10053538、rs13170556和rs9313441用来代表该区域常见多态性变异。结论：湖北汉族人群Tim-3基因的SNPs分布有别于其他人种，基于这些SNPs构建的单体型和筛选出的tSNPs为研究湖北汉族人群Tim-3基因多态性与相关疾病的关系奠定了基础。第二节基于家系的Tim-3基因多态性与变应性哮喘的关联研究目的：探讨Tim-3基因的多态性及其单体型与湖北地区汉族人群变应性哮喘及相关表型的关系。方法：收集湖北地区118个完整的由一名患者及其双亲组成的变应性哮喘核心家系，共354名成员，均为汉族。应用PCR-RFLP方法，对118个核心家系Tim-3基因3个标签SNPs，rs10053538、rs13170556和rs9313441及1个启动子区的多态性rs10515746进行基因分型；采用基于单体型．标签SNP和家系资料的关联检验的方法（TDT，HRR，FBAT），分析Tim-3基因的多态性及其单体型与湖北地区汉族人群变应性哮喘及相关表型的关系。结果：1．Tim-3基因的4个SNPs单个位点TDT和HRR分析结果显示，Tim-3基因的这4个多态性与湖北汉族人变应性哮喘之间不存在连锁不平衡关系，P＞0．05。2．应用TRANSMIT软件进行单体型的TDT分析结果显示，Tim-3基因的单体型与变应性哮喘有关联，Globalχ2检验，χ2=10．83，P=0．013。单个单体型TDT结果显示，父母传递给患病子女G-G-G单体型的观察值小于期望值，差异有显著性（χ2=8．24，P=0．004）。单体型HRR分析显示G-G-G，具有较低的发病风险（HRR=0．49）。3．FBAT分析结果显示Tim-3基因的多态性及单体性与哮喘数量表型血清总IgE水平无关联。结论：Tim-3基因区域的多态性以单体型的形式影响哮喘的易感性，Tim-3基因本身或其附近的染色体区域内可能存在与变应性哮喘易感性相关的位点。单体型G-G-G可能作为用来对湖北汉族人群哮喘易感性进行预测为标志。第三部分基于家系的Tim-1基因多态性与变应性哮喘的关联研究目的：探讨Tim-1基因的多态性及其单体型与湖北地区汉族人群变应性哮喘及哮喘相关表型的关系。方法：收集湖北地区118个完整的由一名患者及其双亲组成的变应性哮喘核心家系，共354名成员，均为汉族。应用PCR—RFLP方法，对118个核心家系Tim-1基因3个标签SNPs（rs4704842、rs953569、rs2134230）和1个位于启动子区的多态位点-232 G＞A以及1个位于外显子4区多态位点rs45623443进行基因分型；采用基于单体型．标签SNPs和家系资料的关联检验的方法（TDT，HRR；，FBAT），检测Tim-1基因的多态性及其单体型与湖北地区汉族人群变应性哮喘及哮喘相关表型的关系。结果：1．Tim-1基因的5个SNPs单个位点TDT和HRR分析结果显示均与哮喘无关联，P＞0．05。2．单体型的TDT和HRR分析发现Tim-1基因区域的G-A-ins-C-G单体型与变应性哮喘有关联，P＜0．05。该单体型由父母传递给患病子女的观察值高于期望值，是变应性哮喘发病的一个风险因素，HRR=1．91。3．FBAT分析结果显示Tim-1基因rs45623443多态性位点Ins等位基因与哮喘表型血清总IgE水平相关，P＜0．05；4．Tim-1单体型的FBAT分析发现G-A-ins-C-G单体型与血清总IgE水平有关联，P＜0．05。结论：Tim-1基因单体型影响湖北汉族变应性哮喘的易感性和血清IgE的水平。提示Tim-1基因内或其附近的基因区域可能存在与变应性哮喘和高IgE水平相关的疾病位点。Tim-1单体型G-A-ins-C-G可能用来对湖北汉族人群哮喘易感性和IgE水平进行预测的标志。