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目的:肺癌是世界范围内死亡率和发病率均居首位的恶性肿瘤。化疗已达到其疗效平台,而靶向药物仅对某些基因突变型有效及产生原发性和获得性耐药均限制了它的使用。.近年来,石菖蒲提取物β-细辛醚在抗癌方面的研究引起广泛关注,并在各种恶性肿瘤中表现出良好的抗癌作用,但其作用机制未明。本研究旨在研究β-细辛醚对肺癌细胞株增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响,并基于Wnt/β-catenin信号通路探讨其可能的机制,为β-细辛醚为代表的中药单体对肺癌等恶性肿瘤的治疗作用提供新的观点和理论基础。方法:1.四种肺癌细胞株(A549、NCI-H1299、NCI-H1650和HCC827)培养基中加入不同浓度β-细辛醚共培养(0μM、200μM、400μM和800μ M),应用MTT法检测不同时间点(24h、48h、72h和96h)细胞的增殖活性。2.应用Transwell小室检测不同浓度β-细辛醚(0 μ M、100 μ M、200 μ M和400 μ M)对肺癌细胞株迁移、侵袭能力的影响;并检测β-细辛醚对肺癌细胞株粘附能力的影响。3.应用流式细胞术Annexin V/PI染色法检测不同浓度β-细辛醚(0μM、100μM、200 μ M和400 μ M)对肺癌细胞株凋亡的影响。4.β-细辛醚促进肺癌细胞凋亡相关机制研究:(1)采用Western blot法检测β-细辛醚对 A549 细胞 Caspase 通路蛋白(Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、PARP)表达的影响;(2)使用不同的Caspase抑制剂作用于A549细胞后Annexin V/PI染色法检测β-细辛醚对A549细胞凋亡的影响;(3)采用Western blot法检测抗凋亡蛋白(XIAP、Bcl-2、Survivin、Bcl-XL)及促凋亡蛋白(XAF1、Bax、Bad、Bak、Puma)的表达;(4)通过线粒体和细胞质分离技术,分别提取A549细胞线粒体和细胞质蛋白,再应用Western blot进一步检测β-细辛醚对A549细胞线粒体和细胞质中Cytochrome C、Bax、Bad、p-Bax 和 p-Bad 表达水平的影响;(5)JC-1 检测β 细辛醚对线粒体膜电位的影响。5.β-细辛醚对A549细胞Wnt/ββ-catenin通路的影响:(1)Western blot检测β-细辛醚对 A549 细胞 Wnt/β-catenin 通路相关蛋白(p-GSK-3 β、DVL2、β-catenin、Cyclin D1、GSK-3 β)表达的影响;(2)双荧光素酶报告基因系统验证β-细辛醚对肺癌细胞Wnt/β-catenin通路活性的影响;(3)采用RT-PCR检测β-细辛醚对A549细胞Wnt/β-catenin通路下游靶基因(c-Myc、CyclinD1、MMP-7)表达的影响。6.激活Wnt/β-catenin通路逆转β-细辛醚诱导的抗肿瘤效应:(1)采用TOPflash/FOPflash双荧光素酶报告基因系统验证Wnt3a对A549细胞Wnt/β-catenin通路的活化效应;RT-PCR验证Wnt3a对A549细胞Wnt/β-catenin通路下游靶基因(c-Myc、Cyclin D1、MMP-7)表达的上调效应;(2)应用Transwell小室检测加入Wnt3a后β-细辛醚对A549细胞迁移、侵袭能力的影响;并检测加入Wnt3a后β-细辛醚对A549细胞株粘附能力的影响;(3)Annexin V/PI染色法检测加入Wnt3a后β-细辛醚对A549细胞凋亡的影响;(4)Western blot检测加入Wnt3a后β-细辛醚对A549 细胞凋亡相关蛋白(Caspase-9、Caspase-3、Bax、pBax(S184)、Puma、Bcl-2、Survivin)的影响。(6)Western blot检测加入Wnt3a后β-细辛醚对A549细胞内Bax、Bad、Cytochrome C蛋白定位的影响。结果:1.MTT检测结果提示,β-细辛醚对四种肺癌细胞株(A549、NCI-H1299、NCI-H1650、HCC827)增殖有抑制作用,随着药物浓度的增高及作用时间的延长,细胞增殖抑制率逐渐增加,并呈时间依赖性和剂量依赖性。2.与正常对照组比较,不同浓度的β-细辛醚作用24h后,均有不同程度的抑制肺癌细胞株(A549、NCI-H1299、NCI-H1650)细胞迁移、侵袭、粘附能力的作用。随着β-细辛醚浓度增加,肺癌细胞株迁移、侵袭、粘附能力逐渐降低,呈剂量依赖性,与未加药物组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。3.与未加药物组比较,不同浓度的β-细辛醚作用48h后,均有不同程度的促进A549、NCI-H1299、NCI-H1650细胞凋亡的作用,且随浓度增加,凋亡率逐渐升高,差异具有统计学意义(β<0.05)。4.β-细辛醚促进肺癌细胞凋亡相关机制研究:(1)与未加药物组比较,procaspase-3、procaspase-9、PARP蛋白表达水平随着药物浓度增加呈现逐渐下降趋势,但 cleaved caspase-3(Active p19/17)、cleaved caspase-9(Active p37/35)、cleaved PARP(p89)蛋白表达水平随着药物浓度增高逐渐升高。procaspase-8及其活性产物的蛋白表达水平并没有显著改变。(2)加入Caspase-9抑制剂(Z-LETD-FMK)和Caspase-3抑制剂(Z-DEVD-FMK)后细胞凋亡率较单用β-细辛醚组降低(p<0.05),加入Caspase-8抑制剂(Z-IETD-FMK)后β-细辛醚诱导的细胞凋亡无明显改变;(3)β-细辛醚呈剂量依赖性促进XAF1、Puma、pBax、pBad的表达及抑制XIAP、Bcl-2、Survivin的表达,对Bax、Bad、Bak及Bcl-XL的表达影响很小。(4)随着β-细辛醚浓度的增加,线粒体内Cytochrome C的含量逐渐减少,相反地释放到胞浆中的Cytochrome C逐渐增加。随着β-细辛醚浓度的增加,线粒体内Bax、Bad、phospho-Bax、phospho-Bad逐渐增加,胞浆内这四种蛋白表达水平则逐渐下降。表明β-细辛醚促进Bax、Bad由胞浆向线粒体转位及Cytochrome C从线粒体内释放到细胞浆。(5)荧光显微镜下观察可见,随着β-细辛醚浓度的增加,A549细胞中的JC-1红色荧光逐渐减弱,JC-1绿色荧光逐渐增强,说明β-细辛醚处理后,A549细胞发生了线粒体膜电位的下降。5.β-细辛醚对A549细胞Wnt/β-catenin通路的影响:(1)Western blot检测结果提示,β-细辛醚明显下调A549细胞中p-GSK-3 β、DVL2、β-catenin、CyclinD1蛋白表达水平及上调GSK-3β的蛋白表达水平。(2)β[-细辛醚呈剂量依赖性下调肺癌细胞Wnt信号报告基因TOPflash-luciferase的表达,与未加药物组比较,相对荧光素酶活性差异有统计学意义(p<0.05)。FOPflash-luciferase的表达(对照质粒)则未发生改变。(3)同时RT-PCR结果提示,在A549细胞中,β-细辛醚呈剂量依赖性下调Wnt/β-catenin通路下游靶基因(c-Myc、Cyclin D1、MMP-7)的表达,与未加药物组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。6.激活Wnt/β-catenin通路逆转β-细辛醚诱导的抗肿瘤效应:(1)双荧光素酶报告基因系统验证结果提示Wnt3a明显上调Wnt信号报告基因TOPflash-luciferase的表达。RT-PCR检测结果提示Wnt3a明显上调c-Myc、Cyclin D1、MMP-7基因的表达。(2)模拟Wnt/β-catenin通路的激活,β-细辛醚对A549细胞增殖抑制作用减弱,能明显逆转β-细辛醚对A549细胞迁移、侵袭、粘附能力的抑制。(3)模拟Wnt/β-catenin通路的激活,能明显逆转β-细辛醚所诱导的细胞凋亡,(4)能明显逆转β-细辛醚所诱导的Caspase-9、Caspase-3的活化,β-细辛醚所诱导的pBax、Puma、Bcl-2、Survivin的表达改变以及pBax、Bax、Cytochrome C在细胞内的定位,都能被Wnt3a有效逆转。结论:(1)β 细辛醚对肺癌细胞株具有抗肿瘤活性。(2)β 细辛醚抑制肺癌细胞株的增殖活性及迁移、侵袭、粘附能力。(3)[-细辛醚通过线粒体介导的内源性凋亡途径促进肺癌细胞的凋亡。(4)β-细辛醚通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抑制肺癌的作用。