【摘 要】
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鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）为黄杆菌科的一种革兰氏阴性菌。虽然现已有多种基因编辑技术用于鸭疫里默氏杆菌毒力因子的鉴定,但仍不能满足现实所需。本研究成功构建了以rpsL及sacB为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌基因缺失方法,并用此方法对相关基因功能进行了鉴定。主要结果如下:1.以rpsL为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌ATCC11845s株基因缺失方法的建立将
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鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）为黄杆菌科的一种革兰氏阴性菌。虽然现已有多种基因编辑技术用于鸭疫里默氏杆菌毒力因子的鉴定,但仍不能满足现实所需。本研究成功构建了以rpsL及sacB为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌基因缺失方法,并用此方法对相关基因功能进行了鉴定。主要结果如下:1.以rpsL为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌ATCC11845s株基因缺失方法的建立将链霉素敏感的ATCC11845菌株培养于含有链霉素的培养基上,筛选出链霉素耐药的突变株-ATCC11845s。野生型的rpsL基因克隆至穿梭质粒pLMF02并转入ATCC11845s中,发现表达野生型rpsL基因的ATCC11845s菌株对链霉素敏感,证明rpsL作为ATCC11845s菌株基因编辑的反向筛选标记。随后构建表达rpsL基因的自杀载体pORS和质粒pBAD24-ermR-rpsL,在此基础上,建立了自杀载体介导的基因缺失法和自然转化介导的基因缺失法两种基因编辑方法。成功敲除鸭疫里默氏杆菌ATCC11845s RA0C＿1534基因,并对其进行了部分功能鉴定。2.以sacB为反向筛选标记的鸭疫里默氏杆菌基因缺失方法的建立将蔗糖致死基因sacB克隆至穿梭质粒pLMF02并转入鸭疫里默氏杆菌CH-1株中。表达sacB的菌株在含有蔗糖的培养基中生长受限,表明sacB可以作为鸭疫里默氏杆菌基因编辑的反向筛选基因。随后构建表达sacB基因的自杀质粒pOBS和质粒pBAD24-cfx-sacB。在此基础上建立自杀载体pOBS介导的基因缺失法和自然转化介导的基因缺失法两种基因编辑方法,并以该方法成功构建鸭疫里默氏杆菌CH-1 dps基因缺失株。3.鸭疫里默氏杆菌CH-1株dps基因功能的研究缺失dps后,CH-1在生长平台期对H2O2更敏感。同时Dps的抗氧化应激能力依赖于胞内铁离子水平,仅在铁离子丰富时发挥作用。凝胶迁移试验结果证实Dps通过结合DNA来保护细菌DNA免受氧化损伤。此外,在细菌对数生长期和平台生长期dps的转录均受H2O2调控并由OxyR介导。等量RA CH-1和RA CH-1Δdps经注射感染雏鸭,分别在感染后24、48、60 h检测多脏器组织的载菌量,发现仅在感染后60 h时缺失株定殖能力显著低于野生株,表明Dps参与鸭疫里默氏杆菌在宿主体内的定殖。
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