第一部分MDM2/MDMX复合物对p53蛋白的调控作用研究　　肿瘤抑制蛋白p53作为一种转录因子可以在多种条件下被激活,通过调节下游基因的表达来调控细胞对应激条件做出的反应,例如细胞周期阻滞、细胞凋亡与衰老以及DNA损伤修复等,从而完成一系列生物学功能。P53的功能失活几乎存在于所有人类肿瘤细胞中,其中在50％的肿瘤中存在p53基因的突变或缺失,其余50％则由于p53异常调控所致。在p53调控的蛋白中,MDM4和MDM2是最为主要的两个p53负性调控因子。　　关于MDM2和MDMX对p53的调控机制一直存在争议,其主要分歧在于两个蛋白是以二聚体形式共同调控p53还是各自独立对p53行使调控功能。有文献报道,人类MDMX第463位半胱氨酸(MDMXC463)为MDM2形成二聚体所必需。为了揭示MDM2和MDMX对p53的调控模式,我们构建了Mdmx/C462A基因敲入小鼠模型。研究发现MdmxC462a/C462A纯合子出现胚胎死亡现象;进一步分析发现MdmxC462A/C462A纯合子小鼠胚胎发育停止于9.5天左右;TLTNEL染色和BrdU掺入研究提示胚胎致死的主要原因是细胞凋亡的增多和增殖的减少。深入分析发现MdmxC462A/C462A纯合子小鼠胚胎细胞中p53蛋白的表达水平和活性明显增加,提示p53活性过高导致胚胎致死。为进一步证实该假设我们将MdmxWT/C462A杂合子与p53-/-小鼠交配得到MdmxWT/C462Ap53+/-双杂合子小鼠,用该基因型雌鼠与雄鼠交配并观察后代基因型,结果发现p53基因敲除小鼠可以完全拯救MdmxC462a/C462A纯合子小鼠胚胎致死的表型,证明了MdmxC462a/C462a胚胎致死依赖于p53的作用。　　总之,我们的研究表明Mdmx/C462A突变后阻止了MDM2和MDMX形成异源二聚体,使p53的水平和活性得到了明显提高,从而导致小鼠胚胎死亡,提示MDM2和MDMX异源二聚体复合物的形成是调控p53的必要步骤。　　第二部分MUC1在食管癌转移中的作用和机制研究　　食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一,高发的组织侵袭和肿瘤转移是导致食管癌患者死亡的主要原因。研究表明MUC1和MMP13在食管癌病人中存在高表达,但二者的相关性未见报道。我们对40例食管癌病人组织和20例癌旁组织标本进行了免疫组化染色,结果发现MUC1蛋白在食管癌病人中显著高表达。更重要的是,在淋巴结转移的病人中MUC1和MMP13都表达增强且有很强的相关性。利用稳转细胞株研究表明MUC1过度表达可以上调MMP13的mRNA表达水平,同时增强细胞的移行能力。进一步通过对MMP13的启动子分析发现,启动子中RUNX2结合位点突变后,MUC1对MMP13的表达调控作用丧失,提示MUC1可能通过RUNX2结合位点来促进MMP13的表达。利用食管癌MUC1基因沉默细胞系的研究发现,当MUC1表达沉默后MMP13的表达水平随之降低,细胞移行能力也明显下降。如果将MMP13在MUC1基因沉默细胞系中过度高表达可以恢复细胞的粘附、聚集、移行和侵袭能力,表明MUC1通过上调MMP13导致食管癌转移的发生。以上结果提示MUC1可以作为新的食管癌诊断标记物和治疗靶点。　　第三部分 MUC1在肺癌发生和治疗中的作用及机制研究　　肺癌由于不易早期发现、治疗方法有限,已成为死亡率最高的恶性肿瘤之一。肺癌主要分为小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)两大类,NSCLC又可分为鳞癌、腺癌和大细胞癌等不同类型。MUC1属于单次跨膜的高分子量糖蛋白,在70％的实体瘤组织细胞中(包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌等)高表达并失去正常极性。为了研究MUC1在肺癌发生中的作用,我们对不同类型肺癌细胞株MUC1的表达进行了检测,结果发现不同病理类型的肺癌细胞当中,MUC1的表达水平有所不同。我们选择MUC1阴性的NCI-H460细胞株构建了MUC1稳定过表达细胞系;同时选择MUC1阳性的NCI-H446细胞株构建了MUC1基因稳定沉默细胞系。通过对两组细胞的功能研究发现NCI-H460细胞株过表达MUC1可以增强细胞锚定非依赖生长的能力和裸鼠体内的成瘤性,同时也可以提高细胞移行和侵袭的能力。而NCI-H446细胞株基因沉默MUC1后以上能力均显著下降。提示MUC1的高表达可以增强肺癌细胞株的致瘤性和转移能力。　　另外,我们研究发现NCI-H446 MUC1基因沉默细胞株由于MUC1表达下调导致了该细胞株对紫杉醇作用的敏感性增加,流式分析结果表明MUC1基因沉默后细胞G2/M期阻滞明显增多,同时细胞凋亡增加。进一步研究提示MUC1可能降低紫杉醇处理后BubR1的磷酸化水平,降低CyclinB1的蛋白水平,从而使细胞逃过紫杉醇导致的细胞周期阻滞。对MUC1在肺癌发生和药物耐受作用机制的深入研究将为肺癌的治疗及预后提供重要的理论意义及应用价值。　　第四部分 AU021092条件性基因敲除小鼠模型的构建　　随着人类和小鼠基因组测序完成,对于大量未知基因的功能研究已成为当前研究的热点。利用基因敲除技术从整体动物水平研究基因功能、人类疾病发病机制和新药作用靶点已成为现代生物学领域最常用的技术手段之一。小鼠AU021092基因定位于小鼠基因组16号染色体,基因全长10478 bp,仅有唯一转录本,由8个外显子组成,转录产物为1375 bp,蛋白编码产物为385个氨基酸。生物信息学分析该基因进化上高度保守,与人的同源性达71％。蛋白结构分析预测AU021092为分泌蛋白,其N端存在20个氨基酸信号肽序列,C端存在4个O-糖基化位点。NCBI数据库显示该基因在人和小鼠的多个组织中广泛表达,在胚胎发育时期也存在表达。目前为止尚未有该基因功能研究的报道。因此,我们构建了AU021092条件性基因敲除小鼠模型,以期从整体动物水平阐明该基因在胚胎发育及成体不同组织器官中的生物学功能,为与该基因相关临床疾病的机制研究和新的药物作用靶点筛选提供重要的理论和实验依据。