研究背景和目的原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)简称肝癌,是最常见的恶性肿瘤之一。在我国,肝癌死亡率占恶性肿瘤死亡率的的第二位。肝癌治疗首选手术切除。但是超过80%的患者在确诊时由于处于疾病的晚期和／或相关的肝脏疾病已失去手术切除的机会。虽然可手术切除患者的5年生存率为50-70%,但是肿瘤复发或肝内转移率是非常高的。因此,寻找预测肿瘤预后的标志物,以及非手术患者潜在基因治疗的靶分子是亟需要解决的问题。微小RNA (miRNAs)是一些5’端带磷酸基团、3’端带羟基的,长度为二十几个核苷酸的非编码调控RNA家族。miRNA是由一系列RNaseⅢ内切酶和转运蛋白等逐步加工完成。在细胞核内,首先由RNA聚合酶Ⅱ或聚合酶Ⅲ转录合成初级miRNA(pri-miRNA),经过Drosha及DGCR8剪切形成miRNA前体(pre-miRNA),然后在输出蛋白5(Exportin-5)和Ran复合物协助下转运出细胞核,随后在细胞质内,被Dicer/TRBP剪切成约22个核苷酸长度的双链RNA。miRNAs通过与靶mRNA 3’-UTR区完全或部分互补结合,导致靶mRNA降解或转录后翻译抑制,从而调控靶基因的表达。miRNAs的主要生物学功能是对基因表达进行转录后调控,可能对每一个遗传途径产生潜在的影响,参与生命过程中一系列的重要进程：如生长发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化等。它们可能作为肿瘤抑制基因或癌基因在肿瘤发生、发展中发挥作用。因此,发挥抑癌作用的miRNA的通常在肿瘤中低表达。据报导,miR-199b在肝癌中下调表达,这表明它可能与肝癌有关。乏氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor 1, Hif-1)是一种依赖氧的转录因子,与其上下游基因及产物形成一个复杂的乏氧调控网络。通过HIF-1调控基因表达促进血管形成、红细胞生成、糖代谢、细胞外基质的代谢以及细胞增值、侵袭、转移等途径。Hif-1由Hif-1α和Hif-1β两个亚基构成的异二聚体,Hif-1发挥作用主要由Hif-1α亚基的表达和活性决定,Hif-1α蛋白表达和转录活性受细胞内氧浓度的精确调控,HIF-1α在缺氧环境下经转录后途径被诱导快速表达。乏氧条件下,Hif-1α水平升高,其转录激活区活性增加。因此,抑制Hif-1α活性,阻断其转录诱导作用可以减少乏氧诱导的血管生成,促进细胞凋亡,降低远地转移能力,消除乏氧肿瘤细胞对放化疗的抗拒作用。有研究表明,低表达的miR-199a和miR-17-92分别在缺氧状态和常氧状态下上调心肌细胞和肺癌细胞中Hif-la蛋白表达。而,在乏氧状态下,无论miR-17-92的表达水平高低HIF-1α都被诱导快速表达,因此,可能有其他miRNA调节Hif1α的表达。我们利用TargetScan 5.1 (http://targetscan.org/), PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/),和miRanda (http://microRNA.org)等多种生物信息分析法预测miR-199b的靶基因,发现miR-199b与乏氧诱导因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,Hif 1α)的3’UTR互补,因此,Hif1α很有可能是miR-199b的靶基因。但是目前还没有明确的证据证明Hif1α是miR-199b靶基因。在本研究中,我们旨在探讨肝癌中miR-199b对Hif-1α的调节作用,并探讨其在肝癌的发生、发展及预后中的作用。方法1、miR-199b在肝癌组织中的表达及临床意义利用实时定量PCR方法检测miR-199b在35例肝癌患者组织和4种人肝癌细胞株及1种人正常细胞株中的表达情况；采用卡方检验分析miR-199b表达水平与各临床病理参数之间的关系；用Kaplan-Meier法分析miR-199b表达与肝癌患者生存期之间的关系。2、miR-199b靶基因分析利用TargetScan 5.1 (http://targetscan.org/), PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de/),和miRanda (http://microRNA.org)等多种生物信息分析法可以预测miR-199b的靶基因,然后用miR-199b前体分子瞬时转染肝癌细胞株,荧光素酶活性实验、表达分析等功能性实验进行靶基因的验证。3、miR-199b功能研究采用miR-199b前体分子瞬时转染肝癌细胞株,四唑盐比色实验(MTT实验和克隆集落形成实验测定细胞存率和观察细胞射线作用后的存活率,探讨miR-199 b调控Hif-1α的机制,明确miR-199b与肿瘤的放射敏感性关系。结果1、miR-199b在肝癌组织中表达下调为了研究miR-199b在肝癌和肝硬化之间的差异表达情况,我们采用实时定量PCR方法分析了35个匹配的肝癌／肝硬化组织中miR-199b的表达水平。与肝硬化组织相比较,在35例肿瘤组织中,27例miR-199b低表达。2、miR-199b的低表达与肝癌患者预后不良相关miR-199b表达与肿瘤的临床分期相关(x 2=5.293,P=0.039),而与性别、年龄、甲胎蛋白(AFP)水平均无相关性(P>0.05)。晚期肿瘤中miR-199b表达水平较低。通过随访获得患者生存时间,运用SPSS 17.0统计软件,采用Kaplan-Meier法,对miR-199b表达与肝癌患者生存时间的关系进行统计分析。结果显示,miR-199b在肝癌中的表达水平与患者的无进展生存率明显相关(P=0.031)。miR-199b高表达患者平均生存时间为54.4个月,而miR-199b低表达患者平均生存时间为33.5个月。即miR-199b表达水平低的患者其预后较差。3、Hif1α是miR-199b的靶基因我们综合利用microRNA, TargetScan,和PicTar algorithms生物学分析软件预测其潜在的靶基因。经比对分析,microRNA, TargetScan均显示Hif1α是miR-199b的潜在靶基因。实时定量PCR的结果发现,4种肝癌细胞株HepG2、Huh-7、HCCLM6、Hep3B中内源性miR-199b表达水平均低于正常肝细胞,其中HepG2的表达水平最低。Western blot结果表明：Hif1α蛋白在人正常肝细胞株中的微量表达,而4种人肝癌细胞株均有表达,其中HepG2和Huh-7细胞表达最高。我们选择这两细胞株探索miR-199b是否负调节Hif1α蛋白的表达,以及荧光素酶活性的测定。Western blot结果显示,转染miR-199b后的Huh-7和HepG2中的Hif1α蛋白表达水平与对照组相比分别降低了23% and 44%,肝癌细胞株中miR-199b下调Hif1α的表达。为了进一步证实Hif1αmRNA的3’UTR区是miR-199b的功能性靶点,我们克隆了Hif1α3’UTR区260bp大小片段,构建到荧光报告质粒载体pGL3的3’下游,命名为pGL3-hif1α载体,与miR-199b、miR阴性对照共转染入HepG2细胞,pRL-TK被用来对转染效率做标准化。与阴性对照组比较,共转染pGL3-hif1α和miR-199b的HepG2细胞荧光酶活性减少了41%,差异有统计学意义(t=46.868,P<0.001)。综合蛋白印迹和荧光素酶活性检测结果,我们首次提出肝癌细胞中Hif1α3’-UTR是miR-199b的一个靶点。4、miR-199b影响肝癌细胞增殖和放射敏感性通过MTT法,我们检测了miR-199b对肝癌细胞体外增殖能力的影响,结果表明,通过4天的比较,与阴性对照组1前体分子相比,miR-199b过表达HepG2细胞增值速度除在乏氧下24小时没有显著性差异(P>0.05),其余时间无论在常氧条件还是在乏氧条件下细胞增值速度均明显减慢,差异具有显著性(常氧下F=119.608,P=0.000；乏氧下F=11.101,P=0.000),说明无论是在缺氧条件下还是在常氧条件下,miR-199b基因的导入明显抑制了肝癌细胞HepG2的体外增殖。本研究中,HepG2克隆效率约为50-60%。转染miR-199b或阴性对照后HepG2细胞的存活曲线在多靶单击模型和线性二次方程模型拟合时均存在统计学意义(多靶单击模型F=47.77,P<0.001；线性二次模型F=62.50,P<0.001)。转染miR-199b后细胞的亚致死损伤修复能力降低和放射敏感性增加。照射+miR-199b组在缺氧条件下的HepG2细胞的放射生物学参数,D0=1.87,Dq=0.24,N=1.14, a/p=21.56, and SF2=0.41,而照射+阴性对照组D0=2.15,Dq=1.19,N =1.74, a/β=4.87, SF2=0.61. miR-199b+照射组的放射增敏比(sensitive enhancement ratio, SER)= DO (NC+照射组)/D0 (miR-199b+照射组)=1.15。结果表明,miR-199b能明显提高肝癌细胞株HepG2在缺氧条件下的辐射增敏作用。然而在常氧下没有观察到miR-199b对HepG2细胞的放射增敏作用。5、Hif1α蛋白表达与miR-199b呈负相关采用western blot方法分析肝癌和肝硬化组织中Hif1α蛋白的表达。与对应的肝硬化组织相比较,在35例肝癌患者中,24例Hif1α蛋白过表达；用：miR-199b表达与Hif1α蛋白水平作图,可以发现肝癌组织中miR-199b的表达与Hif1α蛋白成负相关(r=-0.923,P<0.001)。然而,未发现肝癌组织中miR-199b与Hif1αmRNA之间有相关性。此外,结果还表明miR-199b表达水平与病毒感染、性别和AFP水平没有相关性。结论1.本研究结果显示,miR-199b是在肝癌组织中表达下调,miR-199b可能在肿瘤发生、发展中起重要的调控作用。肝癌中低表达的miR-199b,可能通过上调Hif1α发挥肿瘤抑制因子和放射增敏作用。2.miR-199b表达与肿瘤的临床分期和患者生存时间的关系密切相关。本文创新之处1.我们首次证实肝癌细胞中Hif1α3’-UTR是miR-199b的一个靶点。2.发现miR-199b的表达与肝癌患者的进展、预后及放射治疗的反应相关。