臭灵丹药效部位抗流感病毒及抗炎作用机制研究

来源 :广州医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:hejiashuo
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背景:云南滇药臭灵丹(Laggera pterodonta)是菊科翼齿六棱菊属植物,为临床治疗流感的常用中药。臭灵丹成分复杂,其抗病毒物质基础及药理作用机制也未清晰。目前研究发现乙醇提取物能在体内发挥抗流感病毒作用。醋酸乙酯部位(即本文的药效部位)经过体外初步筛选,能发挥抑制流感病毒的活性作用,抑制病毒效率比乙醇提取物及组分好。为了进一步阐明臭灵丹的抗病毒物质基础,本文在本课题组先前基础上对该药效部位进行体内外药效研究。另外,前期研究发现石油醚萃取分离的臭灵丹酸被发现具有明显的抗病毒抗炎作用并且也在本药效部位中,因此本文使用有效成分臭灵丹酸进行抗病毒靶点抗炎机制研究。目的:(一)对臭灵丹药效部位提取及有效成分臭灵丹酸分离鉴定(二)对药效部位进行体内外药效试验探究其抗病毒及抗炎作用(三)寻找有效成分臭灵丹酸抗病毒靶点及探究其抗炎机制方法:(一)使用乙醇对臭灵丹药材进行提取,使用醋酸乙酯进一步萃取,获得大量药效部位。对石油醚萃取获得的C8组分进行硅胶柱层析分离臭灵丹酸。随后采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间-质谱联用技术(UHPLC-Q-TOF-MS)对药效部位进行分析并鉴定及对臭灵丹酸进行含量测定。(二)以噻唑蓝染色法(MTT法)检测该药效部位的体外细胞毒性,以病毒空斑减少法检测其对不同亚型流感病毒(A/PR/8/34(H1N1)、A/GZ/GIRD07/09(H1N1)、A/HK/4801(H3N2)、A/Aichi/2/1968(H3N2)、A/HK/Y280/97(H9N2)、B/Lee/1940(FLU B))的抗病毒活性。以子代病毒减少法进一步确认药效部位对H1N1,H3N2的抑制作用及使用实时荧光定量PCR检测该部位对流感病毒诱导的炎症因子信使RNA(mRNA)表达水平。使用小鼠和雪貂流感病毒性肺炎模型研究该部位体内抗病毒药效。(三)使用病毒生长曲线实验及聚合酶荧光素酶实验检测臭灵丹酸对流感病毒的作用靶点,使用实时荧光定量PCR检测臭灵丹酸作用于流感感染细胞的RIG-I、TRIAL、Fasl、IFN-α和IFN-β、PD-L1、PD-L2 mRNA表达水平和使用蛋白免疫印迹技术检测臭灵丹酸作用于流感感染细胞的RIG-I、NF-κB/ERK、STAT1等宿主细胞信号通路。结果:(一)对臭灵丹药效部位提取鉴定及有效成分臭灵丹酸分离使用95%乙醇对臭灵丹药材进行提取并且使用醋酸乙酯萃取出药效部位,初步鉴定有119种化学成分,包括倍半萜类、黄酮类、酚酸、有机酸、内酯类等成分,其中也包括臭灵丹酸,为后续体内外抗流感病毒试验及抗病毒抗炎机制奠定基础。(二)臭灵丹药效部位体内外抗流感病毒药效分析臭灵丹药效部位在体外给药模式下对甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、A/GZ/GIRD07/09(H1N1)、A/Aichi/2/1968(H3N2)均有抑制作用,IC50分别为22.1±2.08μg/ml和11.22±1.31μg/ml,44.3±2.1μg/ml,SI分别为3.26、6.42、1.38;子代病毒产量减少法进一步确认该部位在17.5μg/ml(P<0.05)、35μg/ml(P<0.05)、70μg/ml(P<0.05)浓度下均有效抑制A/PR/8/34(H1N1)、A/GZ/GIRD07/09(H1N1)、A/Aichi/2/1968(H3N2)的增殖。在感染48h后,炎症因子mRNA水平检测发现该部位在60μg/ml浓度下对MCP-1(P<0.05)、IP-10(P<0.05)、IL-8(P<0.05)、IL-1β(P<0.05)过表达均有抑制作用。在体内实验中,臭灵丹药效部位分别对A/Aichi/2/1968(H3N2)、A/PR/8/34(H1N1)感染小鼠引起的病毒性肺炎均具有改善作用。A/Aichi/2/1968(H3N2)感染小鼠后,400mg/kg、600mg/kg的臭灵丹药效部位治疗能使小鼠体重的变化减少,肺指数下降(P<0.05),肺部组织病毒滴度也降低(P<0.05)。600mg/kg臭灵丹药效部位治疗后,发现有效抑制BALF液、血清样本中的IL-6(P<0.05)、MCP-1(P<0.05)、RANTES(P<0.05)蛋白水平的过度表达。A/Aichi/2/1968(H3N2)感染的小鼠肺病理显示支气管上皮脱落,坏死,周围淋巴细胞浸润,邻近肺组织、肺间质增宽,组织细胞、淋巴细胞浸润,血管水肿,血管周围炎细胞浸润。400mg/kg、600mg/kg的臭灵丹药效部位均对小鼠的肺病变有所改善,减少炎症细胞浸润。A/PR/8/34(H1N1)感染小鼠后,400mg/kg、600mg/kg的臭灵丹药效部位治疗能使小鼠体重变化减少,肺指数下降(P<0.05),病毒滴度也有所降低(P<0.05)。600mg/kg臭灵丹药效部位治疗发现有效抑制血清中IL-6(P<0.05)、RANTES(P<0.05)蛋白水平的过表达。另外,该部位对雪貂的病毒性肺炎在体征上有改善作用。250mg/kg臭灵丹药效部位治疗组可有效缓解流感病毒感染雪貂的流感样症状,包括缓解体重下降、体温升高、活跃度降低以及鼻部症状。(三)臭灵丹酸抗病毒抗炎机制研究通过病毒生长曲线发现100μg/ml臭灵丹酸在流感病毒用药后24h(P<0.05)、48h(P<0.05)、72h(P<0.05)均有效抑制A/PR/8/34(H1N1)。但对于H3N2来说,100μg/ml臭灵丹酸除了在流感病毒感染后用药24h(P<0.05)有明显抑制外,48h及72h均不能抑制,通过反向遗传技术包装重组病毒初步判断臭灵丹酸作用H1N1的靶点是PB1、PB2、PA、NP、M、NS蛋白。通过聚合酶荧光素酶实验发现50μg/ml(P<0.05)、100μg/ml(P<0.05)、200μg/ml(P<0.05)的臭灵丹酸均能抑制A/PR/8/34(H1N1)聚合酶活性,而不能抑制A/China/LZP/2017(H3N2)聚合酶活性,进一步判断了臭灵丹酸作用于H1N1的PB1、PB2、PA、NP。对于宿主中的炎症通路,100μg/ml臭灵丹酸在mRNA水平(P<0.05)和蛋白水平均能有效抑制模式识别受体RIG-I过表达。然后,使用实时荧光定量PCR验证臭灵丹酸在100μg/ml浓度下有效抑制A549细胞炎症通路中NF-κB通路诱导的促凋亡因子TRAIL/Fasl(P<0.05)的过表达,使用蛋白免疫印迹实验验证100μg/ml臭灵丹酸能抑制炎症相关蛋白NF-κB,ERK的磷酸化及半胱天冬酶3/7过表达。随后,使用实时荧光定量PCR发现臭灵丹酸在100μg/ml浓度下能有效抑制A549细胞干扰素通路中的STAT(P<0.05)、IFN-α(P<0.05)、IFN-β(P<0.05)mRNA的过表达。及使用蛋白免疫印迹实验验证100μg/ml臭灵丹酸能抑制干扰素通路中STAT蛋白磷酸化。最后,使用实时荧光定量PCR验证100μg/ml臭灵丹酸也能有效抑制氧化通路中PD-L1(P<0.05)、PD-L2(P<0.05)的过表达。结论:臭灵丹药效部位有119个化学成分,具有体内外抗流感病毒活性,证实该部位能有效发挥抗流感病毒作用。药效部位中的臭灵丹酸作用机制一是以PB1、PB2、PA、NP为靶点抑制H1N1病毒增殖,二是通过抑制RIG-I/NF-KB/STAT1/I型干扰素和PD-L1/2的激活达到抗炎抗氧化作用来发挥抗病毒作用。
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