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目的和意义:2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者中非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的较高患病率与疾病中肝脏的胰岛素抵抗密切相关。我们前期研究发现胰高血糖素样肽1（glueagons-likepeptide-1,GLP-1）受体类似物利拉鲁肽（liraglutide）可以有效改善肝脏胰岛素抵抗,对NAFLD有缓解作用。同时发现利拉鲁肽可增加初诊糖尿病患者血清的腺苷酸环化酶3（adenylate cyclase 3,ADCY3）水平,且血清ADCY 3水平与胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）呈负相关性。动物研究也发现,除降低血糖外利拉鲁肽还能减轻肥胖小鼠肝脏非酒精性脂肪病变,增加小鼠肝脏ADCY 3的表达,ADCY 3的表达与体重、HOMA-IR及肝脏脂肪沉积面积呈负相关性,利拉鲁肽能上调肝脏ADCY 3/PKA代谢通路,但其下游机制尚未明确。PI3K/Akt是经典的胰岛素受体信号转导通路,而PKA可能通过多个靶标激活PI3K/Akt,从而介导改善肝细胞胰岛素抵抗的作用。因此,我们推测利拉鲁肽可通过影响ADCY 3的表达来上调PKA的活性,进而调节PI3K/Akt胰岛素信号通路,从而发挥改善NAFLD肝脏胰岛素抵抗和脂肪变性的作用。本研究旨在探讨利拉鲁肽是否可通过调控ADCY 3的表达,继而激活PI3K/Akt胰岛素信号通路,改善肝脏脂肪代谢,实现对糖尿病小鼠非酒精性脂肪肝病的保护作用。方法:（1）动物实验（体内实验）:设计2×2析因分析实验。小鼠首先分为两组,每组12只:模型组（high-sucrose-high-fat diet,HFD）通过高糖高脂肪饲料喂养建立具有T2DM的NAFLD小鼠模型,正常对照组（normal control,NC）给予普通饲料喂养。建模成功后,再根据处理方式不同把每组分成两个亚组,药物组用利拉鲁肽0.2 mg/kg治疗10周,而对照小鼠用等量生理盐水处理。最后形成四组:普通喂养+生理盐水（NC+saline,N+S）组,普通喂养+利拉鲁肽（NC+liraglutide,N+L）组,高糖高脂喂养+生理盐水（HFD+saline,O+S）组,高糖高脂喂养+利拉鲁肽（HFD+liraglutide,O+L）组。观察NAFLD小鼠组肝组织脂质紊乱的情况以及利拉鲁肽处理的影响:血液生化分析检测丙氨酸转氨酶（alanine Aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartame Aminotransferase,AST）、甘油三酯（triglyceride,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipid cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipid cholesterol,LDL-C）等的含量变化;测算胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）评估胰岛素抵抗情况;肝脏磁共振质子密度脂肪含量测定（magnetic resonance imaging–estimated proton density fat fraction,MRI-PDFF）检查测定肝组织脂肪含量;苏木精和伊红染色、油红O染色和电子显微镜观察肝脏中甘油三酯的积累;Masson染色观察肝细胞纤维化情况;Real-time quantitative PCR（RT-PCR）和Western blotting（WB）分析肝组织中InsR、IGF-1R、IRS2、PI3K、Akt、PKA、ADCY 3和α-SMA等基因和蛋白的表达。（2）细胞实验（体外实验）:0.3mmol/L油酸刺激诱导HepG2细胞,建立具有脂肪变性的细胞模型,给与高低两种浓度（100 nmol/L、200 nmol/L）利拉鲁肽干预治疗。观察HepG2细胞脂质紊乱的情况以及利拉鲁肽处理的影响:油红O观察细胞中甘油三酯的积聚;real time PCR和Western blotting分析细胞中PI3K、Akt、PKA和ADCY 3在基因和蛋白的表达。同时,通过siRNA转染,对ADCY 3进行基因沉默诱导,研究ADCY 3沉默对下游PKA/PI3K/Akt通路传导的影响。结果:1.动物实验（1）药物治疗前小鼠生理、影像学和组织学评价:与NC组相比,HFD组小鼠体重、血糖、MRI-PIDD值均显著增高（p<0.001）;HFD组小鼠肝组织HE染色显示肝细胞胞浆稀疏、出现脂肪样变,油红O染色和透射电子显微镜观察到肝脏中有脂质滴的存在。（2）利拉鲁肽治疗对小鼠生化指标的影响:HFD组体重、FBG水平、HOMA-IR评分、ALT、AST和TG均显著高于NC组（p<0.05）;利拉鲁肽可显著降低体重、血糖、HOMA-IR、ALT、AST和TG（p<0.05）。TC、HDL-C和LDL-C水平在HFD组和NC组未见显著差异;利拉鲁肽的治疗对TC、HDL-C和LDL-C亦无显著影响。（3）利拉鲁肽治疗对小鼠肝细胞脂质积聚的影响:在HFD组观察到肝组织TG较NC组增高（p<0.05）;经利拉鲁肽治疗后,观察到TG含量表达下降（p<0.05）。N+S和N+L组肝脏组织均显示出正常的结构,未检测到脂质滴;而HFD诱导的O+S组肝小叶结构出现大量脂肪变性,O+S和O+L组的小鼠肝脏中可见脂质滴,但在O+L组可观察到的脂肪积聚的降低,O+L组的小鼠肝脏较O+S组脂质滴积聚明显减少。（4）利拉鲁肽治疗对小鼠肝脏组织纤维化的影响:Masson染色N+S和N+L组肝脏结构正常无纤维化表现;O+S组肝小叶可见蓝色的胶原纤维,提示肝纤维化表现;而O+L组可观察到这一情况的缓解,已无明显纤维化。反映肝纤维化的指标α-SMA在肝脏组织中的基因和蛋白表达均升高（p<0.05）;经利拉鲁肽治疗后,α-SMA的基因和蛋白表达均显著降低（p<0.05）,提示利拉鲁肽的治疗可缓解肝脏纤维化进程。spearman等级相关分析显示:肝脏α-SMA蛋白表达与InsR、IRS2及Akt蛋白表达呈负相关,与HOMA-IR呈正相关,肝脏α-SMA mRNA表达与IRS2、PI3K及AKT mRNA表达呈负相关,与HOMA-IR呈正相关。提示NAFLD的肝纤维化与胰岛素抵抗相关,利拉鲁肽改善NAFLD纤维化进程可能与调控肝脏胰岛素信号通路有关。（5）利拉鲁肽治疗对小鼠肝组织中InsR、IGF-1R、IRS2、PI3K、Akt、PKA、ADCY 3 mRNA表达的影响:与NC组相比,HFD组的InsR、IRS2、PI3K、Akt、ADCY 3 mRNA表达均显著下调（p<0.05）,经利拉鲁肽治疗后,IGF-1R、IRS2、PI3K、Akt、PKA、ADCY 3 mRNA表达均显著升高（p<0.05）。（6）利拉鲁肽治疗对小鼠肝组织中InsR+IGF-1R、IRS2、PI3K、Akt、PKA、ADCY 3蛋白表达的影响:与NC组相比,HFD组的InsR+IGF-1R、IRS2、PI3K、Akt、PKA、ADCY 3蛋白表达均显著下调（p<0.05）,经利拉鲁肽治疗后,InsR+IGF-1R、IRS2、PI3K、Akt、PKA、ADCY 3蛋白表达均显著升高（p<0.05）。2.细胞实验（1）利拉鲁肽干预对油酸诱导脂肪变性的HepG2细胞内TG沉积的影响:油酸诱导脂肪变性的HepG2细胞经不同浓度的利拉鲁肽干预后,模型组TG含量较正常对照组相比明显增加（p<0.05）,胞浆内出现大量的红色脂滴;利拉鲁肽100nmol/L浓度组和利拉鲁肽200nmol/L浓度组TG含量较模型组相比均显著下降（p<0.05）,脂滴数量均有所下降;100nmol/L浓度组较200nmol/L浓度组相比TG的下降更加明显（p<0.05）。对不同浓度利拉鲁肽与细胞内TG含量做spearman等级相关分析显示:细胞TG含量对利拉鲁肽浓度无依赖性。（2）利拉鲁肽干预对油酸诱导脂肪变性的HepG2细胞中PI3K、Akt、PKA、ADCY 3 mRNA表达的影响:模型组和高浓度利拉鲁肽组PI3K mRNA表达与正常对照组相比有下降趋势,然而差异无显著统计学意义;低浓度利拉鲁肽组PI3K mRNA表达与模型组相比显著升高（p<0.05）。模型组Akt mRNA表达与正常对照组相比显著下降（p<0.05）,高浓度利拉鲁肽组Akt mRNA表达与正常对照组相比也有下降趋势,然而差异无显著统计学意义;低浓度利拉鲁肽组Akt mRNA表达与模型组相比有上升趋势,然而差异无显著统计学意义。模型组PKA mRNA表达与正常对照组相比显著下降（p<0.05）;低浓度利拉鲁肽处理组Akt mRNA表达与模型组相比显著升高（p<0.05）。模型组和高浓度利拉鲁肽处理组ADCY 3mRNA表达与正常组对照组相比显著下降（p<0.05）;低浓度利拉鲁肽处理组ADCY 3 mRNA表达与模型组相比显著升高（p<0.05）。对不同浓度利拉鲁肽与细胞PI3K、Akt、PKA、ADCY 3 mRNA表达做spearman等级相关分析显示:PI3K、Akt、PKA、ADCY 3 mRNA表达对利拉鲁肽浓度无依赖性。（3）利拉鲁肽干预对油酸诱导脂肪变性的HepG2细胞中PI3K、Akt、PKA、ADCY 3蛋白表达的影响:模型组和高浓度利拉鲁肽组pPI3K p85/PI3K p85蛋白表达与正常组对照组相比显著降低（p<0.05）;低浓度利拉鲁肽处理组pPI3K p85/PI3K p85蛋白表达与模型组相比显著升高（p<0.05）。模型组和高浓度利拉鲁肽处理组pAkt/Akt蛋白表达与正常对照组相比显著下降（p<0.05）;低浓度利拉鲁肽处理组pAkt/Akt蛋白表达与模型组相比显著上升（p<0.05）。模型组和高浓度利拉鲁肽处理组PKA蛋白表达与正常对照组相比显著下降（p<0.05）;低浓度利拉鲁肽处理组PKA蛋白表达与模型组相比显著上升（p<0.05）。模型组和高浓度利拉鲁肽处理组ADCY 3蛋白表达与正常组对照组相比显著降低（p<0.05）;低浓度利拉鲁肽处理组ADCY 3蛋白表达与模型组相比显著升高（p<0.05）。对不同浓度利拉鲁肽与脂肪变性的HepG2细胞中PI3K、Akt、PKA、ADCY 3蛋白表达做spearman等级相关分析显示:PI3K、Akt、PKA、ADCY3蛋白表达对利拉鲁肽浓度无依赖性。（4）siRNA转染HepG2细胞沉默ADCY 3基因后对ADCY 3、PKA、PI3K、Akt蛋白表达的影响:SiRNA（ADCY 3-siRNA）组ADCY 3、PKA、PI3K、Akt蛋白表达显著下降（p<0.05）。结论:1.利拉鲁肽对NAFLD小鼠可降低体重、血糖及甘油三酯,显著改善肝功能、胰岛素抵抗指数,减轻肝脏脂肪变性及纤维化。2.利拉鲁肽改善肝脏纤维化与脂肪变性可能与调控肝内胰岛素信号通路PI3K/Akt有关。3.利拉鲁肽可通过ADCY 3介导调节PI3K/Akt信号传导来减轻NAFLD的肝脏脂肪变性。