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目的:1.通过网络药理学研究,预测健脾益气方治疗CAG的有效成分和潜在疗效机制。2.通过观察CAG和非CAG患者胃窦组织中Wnt信号启动因子Wnt3A和Rspo1、胃干细胞标志物Lgr5和Sox2、细胞增殖标志物Ki67和PCNA、细胞分化标志物Muc5AC表达差异,探讨CAG发病与胃干细胞增殖、分化的相关性。3.通过建立MNNG诱导的胃类器官CAG模型,观察MNNG对胃干细胞标志物Lgr5、细胞增殖标志物Ki67、细胞分化标志物E-Cadherin、Muc5AC、Muc6表达的影响,探讨CAG发病新机制。4.观察健脾益气方对CAG大鼠Wnt信号启动因子Wnt3A和Rspo1、胃干细胞标志物Lgr5和Sox2、细胞增殖标志物Ki67和PCNA、细胞分化标志物Muc5AC和Muc6等蛋白的表达变化及其调控作用,探讨健脾益气方对CAG分子机制,为解释健脾益气方的疗效作用提供科学依据。方法:1.利用TCMSP数据库筛选健脾益气方活性成分;利用PubChem、DisGeNET和GeneCards数据库筛选活性成分靶点和CAG基因;使用Venn diagrams工具获得活性成分和CAG的交集靶点;使用Cytoscape构建H-C-T网络,筛选健脾益气方主要活性成分;使用STRING数据库和Cytoscape进行PPI分析和PPI网络构建,预测健脾益气方治疗CAG的核心靶点;使用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析,获得健脾益气方治疗CAG相关的信号通路。2.收集2021年10月至2022年1月在江苏省中西医结合医院消化内镜中心行胃镜及病理检查确诊为CAG和非CAG的患者胃窦组织样本,各30例;采用IHC检测方法,对比观察两组胃组织中Wnt3A、Rspo1、Lgr5、Sox2、Ki67、PCNA与Muc5A蛋白表达情况。3.取3周龄SD大鼠1只,提取胃窦组织中的胃干细胞,培养类器官;倒置显微镜动态观察胃类器官的形态变化;使用HE染色、IHC和PCR方法检测胃类器官Lgr5、Ki67、E-Cadherin、Muc6、Muc5AC、Muc2、CDX2表达;选取胃类器官生长状态较好的时间点,用含 10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/LMNNG 完全培养基处理胃类器官,在 0、6、12、24h观察胃类器官的直径和形态变化;选取对胃类器官形态改变最大MNNG浓度和时间点,使用HE染色、IHC和PCR检测方法,对比观察正常生长胃类器官和MMNG处理胃类器官的形态和Lgr5、Ki67、E-Cadherin、Muc5AC、Muc6表达的差异。4.取健康SD大鼠70只,设10只为空白对照组,余60用MNNG+雷尼替丁+饥饱失常饮食的病证结合方法复制脾虚型CAG大鼠模型,共24周。将50只CAG造模成功大鼠随机分为模型组（0.09%氯化钠溶液）、阳性药对照组[叶酸2.7mg/（kgd）+替普瑞酮13.5mg/（kg·d）]、健脾益气方低剂量组[13.1g/（kg·d）]、中剂量组[26.2g/（kg·d）]、高剂量组[52.4g/（kg·d）],每组10只。各药物干预组1ml/100g灌胃,空白对照组1ml/100g 0.09%氯化钠溶液灌胃,共8周。观察大鼠一般状态及体质量变化,HE染色观察胃组织病理改变,IHC、WB、RT-qPCR 测定各组大鼠胃组织中 Lgr5、Sox2、Wnt3A、Rspo1、Muc5AC、Muc6、Ki67、PCNA表达变化。结果:1.网络药理学研究结果:（1）从TCMSP、文献和药典中获取健脾益气方活性成分191种,对CAG具有疗效作用的成分173种,提示柚皮素、槲皮素和豆甾醇可能是健脾益气方治疗CAG的关键成分;（2）健脾益气方治疗CAG的效应靶点167个,PPI分析显示VGEFA、AKT1和IL6可能是疗效作用的核心靶点;（3）GO富集BP条目442条、MF条104条目和CC条目56条,效应靶点产物主要富集在凋亡、炎症反应、蛋白磷酸化、衰老、细胞增殖等生物过程,分子活性富集在酶结合性、蛋白结合性、蛋白激酶活性、激酶活性等方面,效应靶点产物主要活跃在细胞表面、细胞液、细胞膜和细胞外空间等;（4）KEGG富集信号通路122条,P值最小的前17条信号通路包括PI3K-Akt、TNF、HIF-1和FoxO 等。2.临床研究结果:（1）病理特征:CAG组中轻度炎症22例,占比73.33%,中度炎症7例,占比23.33%,重度炎症1例,占比3.33%;非CAG组中轻度炎症24例,占比80.00%,中度炎症6例,占比20.00%,重度炎症0例,占比0.00%,两组炎症程度的差异无统计学意义（P＞0.05）。CAG组中炎症有活动11例,占比36.67%,慢性19例,占比63.33%;非CAG组中炎症有活动8例,占比26.67%,慢性22例,占比73.33%,两组炎症活动性差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）蛋白表达:与非CAG组相比,CAG组胃组织中Wnt3A、Rspo1、Lgr5、Sox2、Ki67、PCNA 与 Muc5AC 蛋白表达均显著下降（P＜0.01）。3.胃类器官实验研究结果:（1）胃类器官建立:大鼠胃类器官呈单层细胞构成的球囊状结构,表达干细胞标志物Lgr5、细胞增殖标志物Ki67、上皮细胞标志物E-Cadherin、胃黏膜小凹细胞标志物Muc5AC、颈粘液细胞标志物Muc6,不表达肠上皮细胞标志物Muc2、CDX2。（2）不同浓度MNNG对胃干细胞直径的动态影响:处理后第24小时,与正常生长的胃类器官相比,40μmol/L和80μmol/L浓度下,胃类器官的直径显著缩小,差异有统计学意义（P＜0.05）;浓度80μmol/L处理的胃类器官,随着时间推移,直径明显缩小,与第0小时相比,第24小时的胃类器官直径显著缩小（P＜0.05）。（3）MNNG对胃类器官形态的影响:与正常胃类器官整体形态相似,MNNG处理后的胃类器官基本呈单层细胞构成的球囊状结构,但球囊壁显著变薄。（4）MNNG对胃类器官细胞标志物表达的影响:与正常胃类器官相比,MNNG处理后的胃类器官Ki67蛋白表达有所下降（P＜0.05）,Lgr5和E-Cadherin蛋白和基因表达显著降低（P＜0.01）,Muc5AC基因表达水平下降,Muc6基因表达水平显著下降（P＜0.01）。4.动物实验研究结果:（1）一般情况:模型组体质量较空白组显著降低（P＜0.01）;各干预组体质量均接近空白组。（2）胃黏膜宏观形态:空内对照组大鼠胃黏膜淡橘红色,有光泽,黏膜皱襞明显且紧密、规则;模型组大鼠胃黏膜呈暗红色,胃窦黏膜灰白,光泽度欠佳,黏膜皱襞明显减少或消失;各干预组胃黏膜呈橘红色,有光泽,黏膜皱襞增加,排列趋向规整。（3）病理组织学形态:空白对照组大鼠胃黏膜上皮结构清晰,腺体数量和形态正常,排列紧密而整齐,炎症细胞浸润少;模型组大鼠胃黏膜上皮明显变薄,腺体显著减少,且排列疏松、杂乱,并可见杯状细胞,炎症细胞浸润多;各干药物预组大鼠胃黏膜上皮增厚,腺体增加,形态趋向正常,排列趋向整齐,炎症细胞浸润减少。（4）Wnt3A和Rspo1蛋白表达:与空白对照组相比,模型组大鼠Wnt3A和Rspo1表达下降（P＜0.05）;与模型组相比,健脾益气方中、高剂量组Wnt3A和Rspo1表达增加（P＜0.05）。（5）Lgr5和Sox2蛋白表达:与空白对照组相比,模型组大鼠Lgr5和Sox2表达明显下降（P＜0.01）;与模型组相比,阳性药对照组、健脾益气方高剂量组Lgr5和Sox2表达增加（P＜0.05）。（6）Ki67和PCNA蛋白表达:与空白对照组相比,模型组大鼠PCNA表达明显下降（P＜0.01）;与模型组相比,各药物干预组大鼠PCNA表达均显著增加（JP＜0.01）;Ki67表达在各组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。（7）Muc5AC蛋白表达:与空白对照组相比,模型组大鼠Muc5AC表达下降（P＜0.05）;与模型组相比,健脾益气方高剂量组Muc5AC表达增加（P＜0.05）。（8）基因表达:与空白对照组相比,模型组大鼠胃组织Lgr5、Wnt3A、Rspo1、Muc5AC和Muc6基因表达水平都有下降趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）;与模型组相比,健脾益气方高剂量组Lgr5、Wnt3A、Muc5AC和Muc6基因表达水平显著上升（P＜0.05）。结论:1.网络药理学研究发现,健脾益气方对CAG疗效作用主要与组方中的柚皮素、槲皮素和豆甾醇等活性成分有关,途径有PI3K-Akt、TNF、HIF-1等多条信号通路,作用于VGEFA、AKT1、IL6等多个效应靶点,其结果为进一步探索健脾益气方治疗CAG的作用机制和靶点提供了一定的研究方向和理论依据。2.临床研究和胃类器官研究发现,CAG发病可能与低活化或抑制状态的Wnt信号下,胃干细胞增殖和分化受阻,无法及时补充腺体细胞,从而修复胃黏膜的分子病理机制相关。这一CAG发病新机制的探索,为揭示和解释中医药对CAG发挥疗效的分子病理机制研究提供了新思路和科学依据。3.健脾益气方对CAG的疗效作用与调控Wnt信号通路相关蛋白的异常表达相关,能够增加Wnt信号启动因子表达,一定程度上激活Wnt信号,促进胃干细胞的增殖和分化,补充腺体细胞,修复黏膜损伤。研究为解释健脾益气方对CAG疗效作用的科学内涵提供了一定的依据。4.本研究结果进一步阐释了健脾益气方对CAG疗效作用的分子机制,探索了中医药对CAG作用微观靶点的研究方向;在国内较早从胃类器官研究领域,揭示了 CAG发病可能潜在的分子新机制,并将其前沿技术,引入中医药疗效作用的机制研究,为科学、微观地实证中医药对CAG的疗效作用提供了借鉴。