【摘 要】
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过去十几年的研究发现,细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)作为细胞间通讯的重要介质,参与原核生物和高等真核生物细胞间生物信号的传递,并调节多种生物过程。此外,胞外囊泡的病理生理学作用也开始在许多疾病进程中有所体现,包括癌症、感染性疾病和神经退行性疾病等,突出其在干预治疗过程中作为一种潜在新靶点的地位。但是由于缺乏适当的追踪技术,人们对胞外囊泡与受体细胞的相互作用了解甚
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过去十几年的研究发现,细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)作为细胞间通讯的重要介质,参与原核生物和高等真核生物细胞间生物信号的传递,并调节多种生物过程。此外,胞外囊泡的病理生理学作用也开始在许多疾病进程中有所体现,包括癌症、感染性疾病和神经退行性疾病等,突出其在干预治疗过程中作为一种潜在新靶点的地位。但是由于缺乏适当的追踪技术,人们对胞外囊泡与受体细胞的相互作用了解甚少。基于此,本文利用化学酶辅助的方法构建了胞外囊泡共价标记新模型,并借此方法实现了细胞摄取胞外囊泡这一过程的可视化研究。具体内容如下:1、构建化学酶辅助的细胞外囊泡标记新方法。本章发展了一种化学酶标记新技术,该方法首先使用磷脂酶D(phospholipase D,PLD)催化天然囊泡膜上的磷脂酰胆碱与炔基实现胆碱的原位交换。随后通过炔基-叠氮点击化学反应就可将含叠氮基的荧光染料分子标记在囊泡膜上,并可通过共聚焦荧光显微镜得到标记囊泡的荧光图像。其后对囊泡形态学和生物功能进行各项表征,结果说明胞外囊泡的酶辅助荧光标记是一种高效且生物相容性极佳的方法,该过程不影响胞外囊泡的物理形态和生物学活性。另外,通过稳定性实验也证实,与通过传统膜插入性染料标记的囊泡相比,该方法标记的囊泡具有更好的保持效果,即使在相对复杂的生物环境中,染料仍能修饰在囊泡上,因此该方法在细胞成像以及生物分析等领域将有较广阔的应用前景。2、酶辅助荧光标记囊泡在细胞内化过程中的成像研究。我们借助上述化学酶标记策略得到Cy5染料标记的囊泡,并将其应用于监测癌细胞衍生胞外囊泡的细胞内在化过程。我们对免疫吞噬细胞RAW264.7摄取囊泡的过程进行了瞬时及长时监测,探究了囊泡进入该细胞的瞬时过程及伴随时间梯度的摄取效果,并利用多种特异性较强的摄取通路抑制剂进一步揭示了上述内在化过程可能存在的相关机制。这种生物相容性良好的标记策略可成为胞外囊泡的化学生物学研究以及药物递送的临床研究提供必不可少的工具。
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