论文部分内容阅读
溶菌酶又称胞壁质酶,是一种天然的碱性蛋白质。溶菌酶不仅可以水解细菌细胞壁中的肽聚糖,导致细胞壁破裂,菌体溶解,而且能够与病毒蛋白直接结合使病毒失活,因而具有抗菌、抗病毒、消炎等功效。溶菌酶还常被用作模型蛋白,用于研究蛋白质的构象、酶动力学及其与分子免疫间的关系等。目前,常用的溶菌酶检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)等。CE由于分析速度快、分离效率高、试剂消耗量少等优点广泛用于蛋白质的分离分析中。紫外检测器(UV)是CE最常用的检测方式,然而由于毛细管进样体积小、检测光程短,致使CE-UV的检测灵敏度受到限制。为提高检测灵敏度,在线富集技术应运而生。在线富集技术是通过调节目标分析物所处状态以及仪器参数使分析物得到富集,从而达到提高检测灵敏度的目的,具有操作简便、价格低廉的优点。本论文通过一步加热法制备了一种对溶菌酶具有吸附/释放功能的混合刷涂层毛细管,用于毛细管电泳在线富集溶菌酶以提高检测灵敏度。主要内容如下:首先分别通过阳离子开环聚合和可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合合成聚(2-甲基-2-噁唑啉)(PMOXA)和不同链长的聚丙烯酸(PAA),然后将甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)分别与PMOXA和不同链长的PAA通过自由基共聚和RAFT聚合合成出聚(2-甲基-2-噁唑啉)-r-甲基丙烯酸缩水甘油酯(PMOXA-r-GMA)和聚丙烯酸-b-聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PAA-b-PGMA)。将PMOXA-r-GMA和PAA-b-PGMA的混合溶液以一定比例加入到毛细管内,通过一步加热即可制备出基于PMOXA和PAA的混合刷涂层毛细管。X射线光电子能谱(XPS)对毛细管原材料的表面组成测试结果表明,采用一步加热法可成功制备PMOXA-r-GMA/PAA-b-PGMA涂层,而且涂层中羧基的含量随着PAA链长的增加而增加。异硫氰酸荧光素标记溶菌酶(FITC-溶菌酶)吸附实验结果显示,改变环境的pH和离子强度(I)可以调控涂层毛细管对溶菌酶的吸附和释放,在pH 7和I=1(T5mol/L条件下,毛细管可以吸附大量的溶菌酶,当条件变为pH 3和I=10-1 mol/几后,吸附的溶菌酶可以被释放出来。将这种对溶菌酶具有吸附/释放功能的混合刷涂层毛细管用于毛细管电泳在线富集溶菌酶。在优化条件下,比较了不同涂层毛细管在线富集溶菌酶的情况,与单组分PAA-b-PGMA涂层毛细管相比,PMOXA-r-GMA的加入使PMOXA-r-GMA/PAA-b-PGMA涂层毛细管具有更好的在线富集效果。同时发现,随着PAA链长的增加,PMOXA-r-GMA/PAA-b-PGMA涂层毛细管对溶菌酶的富集效果得到提高。当PAA链长是PMOXA链长的2.2倍时,溶菌酶的富集效果最佳,基于峰面积和峰高的灵敏度增强因子分别为17.69和6.74,检出限和定量限分别为8.7 × 10-5 g/L、3.0 × 10-4 g/L;峰面积的日内、日间的相对标准偏差(RSD)分别为2.9%、4.1%,迁移时间的日内、日间RSD分别为0.9%、2.1%。涂层的制备只需一步,简单易行,而且涂层具有很好的稳定性。本研究为毛细管电泳分析痕量溶菌酶提供了一种简单有效的方法。