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研究背景与目的乳腺癌是女性中发病率最高,危害最严重的恶性肿瘤之一,虽然近年来乳腺癌的综合治疗效果有了明显的改善,然而目前全世界每年仍有近46万人死于乳腺癌,乳腺癌的化疗耐受和复发转移是导致乳腺癌患者死亡的最重要原因。多年来,虽然对乳腺癌化疗耐受的机制研究取得了一定进展,但仍远未阐明,近年来的研究提示肿瘤干细胞可能是导致化疗耐受的重要原因。为了进一步研究乳腺癌化疗耐受的机制,本课题组前期通过体外诱导建立了获得性5-Fu耐受的细胞系MCF-7/5-Fu,该细胞系表现出明显的上皮间充质转化现象(EMT)和乳腺癌干细胞特性。本课题将以乳腺癌获得性耐药细胞系MCF-7/5-Fu和先天性耐药细胞系MDA-MB-231为研究模型,探讨Bmi1在乳腺癌化疗耐受中的作用及其表达调控的可能机制,为识别乳腺癌耐药新的标志物,阐述乳腺癌化疗耐药的分子机制,开发以标志物为靶的干预及逆转化疗耐药的药物提供理论依据。方法(1)RT-qPCR和Western Blot检测乳腺癌细胞MCF-7、MCF-7/5Fu、 MDA-MB-231、MDA-MB-4534中Bmi1的nRNA和蛋白表达水平,MTS试验检测各细胞对5-Fu的敏感性。(2)构建Bmi1干扰载体pRNAT-shBmi1,利用过表达和干扰Bmi1的质粒转染细胞后,分别用puromycin和Blasticidin筛选建立相应稳定细胞系,Western Blot检测Bmi1及凋亡相关分子的表达变化,MTS检测各细胞系对5-Fu的敏感性,并计算IC50值。(3)用100mg/L的5-Fu处理过表达和干扰Bmi1的细胞系,流式细胞术检测细胞凋亡变化情况,酶标仪检测Caspase-9及Caspase-7活性及线粒体凋亡途径的活化情况。(4)流式细胞技术检测Bmi1干预后各乳腺癌细胞系中CD44+/CD24-/low乳腺癌干细胞亚群比例的变化。(5)生物信息学预测靶向Bmi1的microRNAs,选取在各物种间保守性高的microRNAs包括miR-200c和miR-203用于进一步研究；miRNA特异性实时定量PCR检测各细胞系中miR-200c和miR-203的表达情况。用脂质体转染法将miR-200c mimics和miR-203表达载体pSlience-U6-miR-203导入MCF-7/5-Fu, MDA-MB-231及MDA-MB-453细胞,miRNA特异性实时定量PCR检测转染效果,western blot检测Bmi1的表达变化；将含有miR-200c和miR-203结合位点的Bmi1的3’-端非翻译区(3’-UTR)的野生型或结合位点突变的DNA序列克隆入pMIR-Report报告基因载体,用双荧光素酶报告实验检测miR-200c和miR-203对Bmi1的靶向调控作用。(6)miRNAs实时定量PCR检测Bmi1干预前后各细胞中miR-200c和miR-203的表达变化,将野生型p53表达载体pEGFP-N1-p53导入各细胞中,实时定量PCR检测p53转染前后细胞中miR-200c的表达变化,Western Blot检测Bmi1干预前后p53的表达变化,并用免疫共沉淀技术检测乳腺癌细胞中Bmi1与p53的结合情况。结果(1)Bmi1mRNA水平在MCF-7、MCF-7/5Fu、MDA-MB-231、 MDA-MB-453中无明显差异,蛋白表达水平在MCF-7中明显低于在MCF-7/5Fu、MDA-MB-231和MDA-MB-453中的表达水平。(2) Bmi1过表达可明显增强MCF-7对5-Fu的耐受性,凋亡比例下调；干扰下调Bmi1表达可增强MCF-7/5Fu、MDA-MB-231、 MDA-MB-453对5-Fu的敏感性,提高凋亡细胞比例。(3) Bmi1能上调Bcl-2的表达,抑制Bax的表达,干扰Bmi1的表达能增加5-Fu诱导的线粒体凋亡途径的活化,表现为Cyto-C释放增加,Caspase9和Caspase7活性增加。(4) Bmi1能够上调乳腺癌细胞中CD44+/CD24-干细胞亚群的比例。(5)生物信息学预测发现Bmi1的3’-UTR各有1个在物种间保守的miRNA200c和miRNA203结合位点,过表达miRNA200c和miRNA203能抑制Bmi1的蛋白表达,双荧光素酶报告实验证实miRNA200c和miRNA203能直接靶向调控Bmi1的蛋白表达。(6) Bmi1能够负向调控miRNA200c的表达,而对miR-203的表达无影响,过表达野生型p53可上调miRNA200c的表达且能逆转Bmi1对miRNA200c的表达抑制作用。(7) Bmi1能下调乳腺癌细胞中野生型p53的蛋白水平,且和p53存在直接结合。结论1.Bmi1通过抑制线粒体途径介导乳腺癌细胞的5氟尿嘧啶耐受；2. Bmi1可以上调乳腺癌CD44+/CD24干细胞比例群的能力；3.miRNA200c在乳腺癌中能够靶向调控Bmi1的表达；4.首次证实了miRNA203能靶向调控Bmi1的表达；5. Bmi1通过p53负反馈抑制miRNA200c的表达。