在合并糖尿病、放射损伤等情况下,创面常常延迟愈合或转变为慢性难愈性创面,这成为长期困扰临床治疗的一大难题。通常采用的皮肤移植疗法,无论自体还是异体皮都受到供体来源少的限制,异体皮和人工合成皮还存在免疫排斥等问题。创面愈合受抑的原因是多方面的,包括迁移至创面的炎细胞数量减少、生长因子合成降低以及胶原形成障碍等。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)是来源于骨髓的多能干细胞,可以向多种细胞分化,如成纤维细胞、骨、软骨、肌肉和神经细胞等。BMSCs还可以分泌多种与创面愈合有关的细胞因子和生长因子,如TGF-β、G-CSF、IL-6、IL-8、TNF-α等。BMSCs来源广泛,获取方便,体外扩增能力强,成为细胞治疗和基因治疗遗传性或获得性疾病的焦点。血小板源性生长因子(PDGF)储存在循环血小板的α颗粒中,创伤时,由血凝块首先释放,随后在愈合过程中由巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞和表皮细胞合成分泌,参与创面的修复,被称为“损伤修复因子”。重组PDGF产品Becaplermin,已经被美国FDA批准用于糖尿病溃疡的治疗。难愈性创面,很容易变成各种微生物的培养基,进而阻碍愈合进程,因此防治创面感染对促进局部创面愈合以及改善全身情况都是有利的。人β防御素2 (human beta defensin-2,hBD2)作为天然抗微生物肽,对革兰阴性菌有很强的杀菌作用,对革兰阳性菌也有明显的抑菌效果。血小板源性生长因子和防御素分别作用于创伤愈合的不同靶点,若联合应用可能会有协同作用。很多细胞可作为基因转染的受体细胞或靶细胞,一般要根据创面愈合的特点、愈合的部位、目的基因及其表达载体和基因转染的方式来确定。在大多数外伤(如皮肤切割伤、烧伤等)创面愈合过程中,成纤维细胞和表皮细胞起着非常重要的作用。选择受体细胞时应注意以下几个特点:(1)受体细胞容易获取;(2)体外方便培养及传代;(3)易于基因转染并有效表达;(4)回植细胞易成活并能稳定表达目的蛋白。符合以上条件的细胞主要有骨髓间充质干细胞、成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞等。不同基因修饰后,受体细胞可能会出现不同程度的细胞生物学和(或)分子生物学的变化,这种基因相关的个性改变应逐一进行检验,以确定其作为种子细胞的有效性。我们知道,干细胞的某些特点和优势往往也是干细胞治疗的风险所在。干细胞的来源与种类、体外基因转染处理条件、移植细胞数量、移植治疗时机、植入途径、植入部位、疾病与病程的选择等等因素均会影响到干细胞治疗的疗效和安全性。目前的的移植实验多为先在体外增殖、转染、诱导、分化成为相应组织细胞后再植入体内,倘若以上操作会改变细胞特性,那么一旦大量运用到临床治疗上,就会发生种种无法预测的后果。miRNAs是一种调控基因表达的小分子RNA,在细胞生长、发育、代谢等重要的生命过程中扮演重要角色。miRNA发挥作用的方式是作为一种引导性分子通过碱基配对与靶mRNA结合从而在转录后水平引起靶mRNA的剪切或是翻译的抑制。本研究所同期研究证实,一些miRNAs在创伤愈合中存在着显著的表达变化,比如:has-miR-21、mmu-miR-712、rno-miR-31等等。其中has-miR-21在多种生物及哺乳动物多种组织中广泛存在,体外实验中证实miR-21充当了抗凋亡因子的角色。我们推测,miR-21的高表达很可能封闭了促进细胞分化和凋亡所需要的某些基因,使细胞处在原始的增殖发育阶段。本研究拟用成功构建的hPDGF-A和hBD2双基因共表达腺病毒载体转染BMSCs,作为种子细胞的安全性,观察其生物学特性的改变;作为种子细胞的有效性,研究其在小鼠皮肤切割伤创面促愈的可能机制;另外对miR-21在10T1/2小鼠间充质细胞的表达变化及其对皮肤切割伤创面愈合的作用机制进行初步探讨。主要方法和结果如下:1.本部分实验拟用hPDGF-A/hBD2双基因共表达腺病毒载体Adv-hPDGF- A-IRES-hBD2转染骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察外源基因修饰对干细胞本身的生物学性状的影响,以明确其作为外源基因载体和组织修复种子细胞的安全性。通过密度梯度法体外分离大鼠BMSCs,贴壁培养至第3代,用于基因转染。同时,应用GFP标记的腺病毒表达载体系统Adv-hPDGF-A-IRES-hBD2,以脂质体法转染293细胞,通过重组腺病毒在293细胞中的包装和扩增以及病毒滴度、感染效率的测定,得到稳定的转染条件,转染MSCs后,对转染目的基因后的BMSCs进行形态学观察,绘制生长曲线,测定其细胞周期以及向成脂、成骨、成肌诱导分化能力的改变。结果显示hPDGF-A/hBD2双基因成功转入BMSCs后,从形态学上观察未发现明显变化;通过台盼蓝染色BMSCs的活细胞率为77%～88.2%,与未经病毒感染的正常对照细胞相近,未发现其对细胞活性有明显作用;转染双基因的BMSCs其增殖活性没有受到抑制,反而在一定程度上能促进细胞的增殖能力;基因修饰后的BMSCs仍具有成体干细胞所具备的增殖能力,以及向成脂、成骨、成肌等方向分化的潜能。2.本部分实验旨在探讨Adv-hPDGF-A-IRES-hBD2转染的骨髓间充质干细胞局部移植后对切割伤创面修复的可能机制。制备小鼠皮肤切割伤模型,以局部多点注射移植感染重组腺病毒的BMSCs组为实验组(T组),以注射PBS为对照组(C组)。在移植后7d、14d、21d观察创面愈合大体情况,各时相点分别取材,石蜡切片经HE染色,观察创面病理形态变化;免疫荧光组织化学法检测带GFP(+)的BMSCs在创面的分布以及创面bFGF表达情况;免疫荧光双标观察外源MSCs在创面的表达和分化( GFP和FVIII)。大体观察,结果显示,在各时相点,与C组比较,T组创面感染程度较轻,愈合速度较快;荧光显微镜观察结果显示,至少在移植后两周之内BMSCs可以较高水平地表达以EGFP为指示的外源基因。新生肉芽组织中bFGF的表达明显增加,以MSC植入后7～14d新生肉芽组织中的成纤维细胞表达尤为明显;在创伤后7d和14d都能看到带GFP的外源MSC参与到创面血管的形成中,推测其分化为血管内皮细胞和(或)周细胞参与血管的再生。本实验观察到,GFP标记的MSCs出现在创面血管周围,同时表达FⅧ,尤以创面愈合过程中的血管增生高峰期(伤后1-2周)为甚,提示创面愈合过程中MSCs可以直接转化为血管内皮细胞。3. miR-21有抗凋亡、促增殖的作用,本部分实验拟观察miR-21在皮肤切割伤创面愈合中的表达情况。经TGF-β诱导10T1/2细胞后,CCK观测对其增殖的影响,Northern blot检测miR-21的表达变化,RT-PCR检测基因Bcl-2、PTEN、TMP1表达的变化。同时取切割伤后4d,7d创缘新生肉芽组织,提取RNA,做microRNA基因芯片分析(gene microarray analysis),Northern blot检测miR-21的表达情况。实验结果显示,10T1/2经TGF-β诱导后,增殖明显,同时血管周细胞的抗原α-SMA和NG2表达阳性;Northern blot检测miR-21的表达增高;但将10T1/2细胞内miR-21 knock-down后,可以明显降低TGF-β诱导后的细胞增殖。RT-PCR结果显示经TGF-β诱导后,10T1/2细胞内Bcl-2基因表达上调,而PTEN和TMP1表达下降。小鼠皮肤切割伤后4d和7d创缘组织的基因芯片分析和Northern blot检测发现miR-21均表达上调。细胞模型和小鼠实验结果均间接提示miR-21在MSCs创伤促愈过程中可能起了一定的正向调控作用。