背景慢性鼻-鼻窦炎（chronic rhinosinusitis,CRS）是耳鼻喉科非常常见的一种炎症性疾病,CRS的发生是多种因素相互作用的结果,细菌的感染和生物膜的形成是其中的一个重要因素。细菌生物膜（bacterial biofilm,BBF）是细菌形成的有一定空间构造的高度组织化的结构,是不同于游离菌为适应自然环境而形成的另外的一种存在形式。随着生物膜的形成,细菌对抗生素类药物的抵抗及宿主的免疫功能将比着游离菌大大的增强。生物膜内部所包含的细菌具有极强的耐药性,与游离菌相比,生物膜对抗生素的耐药性将提高1000倍以上。部分CRS患者虽然经过鼻内镜鼻窦手术及综合规范化治疗,但是其临床疗效却没有得到明显的改善。外科手术虽然可以直接清除生物膜及其病变的黏膜,但是在手术的过程中,我们用肉眼是无法确定生物膜存在的位置以及累及病变黏膜的具体范围的,所以如果仅仅依靠手术来清除生物膜还是远远不够的。金黄色葡萄球菌生物膜已经被证实是造成CRS难治化的重要原因之一。在健康人体的鼻窦内,内源性的一氧化氮（Nitric oxide,NO）被证明是高度浓缩的,但是在慢性鼻-鼻窦炎患者中却发现内源性NO的水平很低,从而造成了对细菌的杀灭作用减弱,这也可能是造成CRS难治性的原因之一。NO已经被证实有抗菌和抗病毒的特性,NO在固有免疫、纤毛运动和腺体的分泌中起着非常重要的作用。已有文献证实NO可以有效的杀灭多种病原微生物的生物膜,也包括金黄色葡萄球菌生物膜。而我们的前期试验也已经证实一氧化氮能够有效杀伤金黄色葡萄球菌生物膜。单硝酸异山梨酯（Isosorbide Mononitrate,ISMN）是一种NO供体药物,已经被广泛的运用到心血管内科的临床上。本研究针对目前综合治疗对金黄色葡萄球菌生物膜阳性CRS患者疗效欠佳的现状,我们拟构建金黄色葡萄球菌α毒素（Alpha hemolysin,Hla）抗体修饰的包裹一氧化氮供体药物单硝酸异山梨酯的纳米颗粒,并对其基本理化性质进行考察,通过激光共聚焦、酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,Elisa）、实时荧光定量聚合酶链反应（Realtime polymerase chain reaction,Realtime PCR）等方法,在体外培养的细胞中及慢性鼻-鼻窦炎动物模型中进行实验,探讨新型主动靶向纳米颗粒杀灭金黄色葡萄球菌生物膜的作用机制及治疗金黄色葡萄球菌生物膜相关CRS的可行性,为难治性CRS治疗提供新的策略。本研究主要有以下四部分组成:第一部分 金黄色葡萄球菌α毒素单克隆抗体的制备目的制备金黄色葡萄球菌α毒素单克隆抗体,为后续单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒的制备提供条件。方法通过构建pET28a/H1a重组质粒,将HLA蛋白进行原核表达,最终获得纯化的HLA重组蛋白。再以纯化的H1a重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0通过脾细胞融合法融合后筛选抗体阳性杂交瘤细胞株。将筛选到的杂交瘤细胞株以BALB/c小鼠为载体制备腹水,辛酸-硫酸铵法来进行腹水的纯化并获得抗HLA单克隆抗体;将制备得到的小鼠抗HLA单克隆抗体采用Western blot法检测其是否能够与金黄葡萄球菌裂解物及HLA重组蛋白反应,以证明制备的抗体的特异性。结果1.以金黄色葡萄球菌（ATCC25923）基因组为模板进行PCR扩增,成功的扩增出了目的基因片段,并构建了重组的原核表达质粒pET28a/H1a。2.将重组表达质粒pET-28a/H1a对细胞进行转染,获得了纯化的Hla蛋白。3.以纯化的H1a蛋白作为抗原,对BALB/c小鼠进行免疫,最终得到了可以分泌H1a蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。4.本实验成功制备出金黄色葡萄球菌α毒素抗体,采用Western blot验证了所制备出来抗体具有较强的特异性。结论成功的制备出金黄色葡萄球菌α毒素单克隆抗体,抗体有较强的特异性,可以做为靶向基团连接到脂质体上。第二部分 单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒的制备目的制备包裹ISMN的金黄色葡萄球菌α毒素抗体修饰的靶向纳米颗粒。方法采用单因素优化ISMN脂质体的制备工艺,来筛选出最佳的磷脂浓度、磷脂/胆固醇质量比、脂/药比。采用正交试验设计筛选出最优的处方,并对所制备的脂质体的基本理化性质进行考察。通过戊二醛交联的方法将抗体与脂质体进行连接,制备ISMN靶向纳米颗粒,并对靶向纳米颗粒进行粒径、包封率、载药率以及抗体连接效率的考察。结果对制备出来的同一批单硝酸异山梨酯脂质体进行基本理化性质的考察,测其粒径为 136.8±7.414nm,包封率为 19.03±1.595%,电位为-1.145±0.095。在4℃条件下存放第15天,测其粒径为137.9±7.432nm,包封率为18.53±0.838%,电位为-1.09±0.042。在4℃条件下存放第30天,测其粒径为147.7±7.325nm,包封率为17.10±1.435%,电位为-1.05±0.061。运用统计学分别对三个不同时间点的粒径、包封率及电位进行分析,发现在三个不同的时间点,两两比较差异无统计学意义（P>0.05）,即在4℃条件下存放一个月,脂质体的粒径、包封率和电位基本不变。制备出的单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒,粒径为169.3±6.780nm,包封率为16.9±1.52%,载药率为2.36±0.19%,抗体连接效率为30.68±2.39%。结论成功制备出粒径符合实验要求的单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒,经过修饰及抗体偶联后理化性质稳定,可用于后续实验。第三部分 单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒对体外金黄色葡萄球菌生物膜的作用目的通过体外实验研究单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒对金黄色葡萄球菌生物膜的作用。方法在体外对金黄色葡萄球菌参考株（ATCC25923）进行培养,通过96孔培养板和8孔培养玻片建立金黄色葡萄球菌生物膜体外模型。分别用药物浓度为45mg/ml、23mg/ml、11mg/ml的单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒、单硝酸异山梨酯脂质体和单硝酸异山梨酯对金黄色葡萄球菌生物膜形成的不同阶段进行干预,通过结晶紫染色、Alamar Blue实验和激光共聚显微镜来观察分析干预效果。结果对金黄色葡萄球菌生物膜形成的干预,结晶紫实验结果显示,金葡菌ATCC25923和ISMN免疫脂质体（其药物浓度分别为45mg/ml,23mg/ml,11mg/ml）作用后,其生物膜形成分别减少到2.16±0.22%、38.42±4.44%、62.38±5.01%,金葡菌ATCC25923和ISMN脂质体（其药物浓度分别为45mg/ml,23mg/ml,11mg/ml）作用后,其生物膜形成分别减少到18.26±5.21%、58.31±3.15%、82.50±3.10%、金葡菌ATCC25923和单纯ISMN药物（其药物浓度分别为45mg/ml,23mg/ml,11mg/ml）作用后,其生物膜形成分别减少到35.7±2.87%、76.37±5.65%、82.61±5.68%。在药物浓度为 45mg/ml、23mg/ml、11mg/ml 时,免疫脂质体的抑制生物膜形成的作用均比脂质体和单纯的药物的抑制作用要强（所有P<0.05）,在药物浓度为45mg/ml、23mg/ml时,脂质体的抑制生物膜形成的作用比单纯的药物抑制生物膜形成的作用要强（所有P<0.05）。在药物浓度为11mg/ml时,ISMN脂质体的抑制生物膜形成的作用与单纯的药物ISMN抑制生物膜形成的作用相比差异没有统计学的意义（P>0.05）。对已经形成的金黄色葡萄球菌生物膜的干预,Alamar Blue实验结果显示,金葡菌ATCC25923生物膜和ISMN免疫脂质体（药物浓度分别为45mg/ml,23mg/ml,11mg/ml）作用后,其抑制率分别为 96.67±2.08%、50.33±5.86%、21.33±3.06%,金葡菌ATCC25923生物膜和ISMN脂质体（药物浓度分别为45mg/ml,23mg/ml,11mg/ml）作用后,其抑制率分别为 77.33±3.06%、36.67±3.51%、19.00±5.29%,金葡菌ATCC25923和单纯药物ISMN（药物浓度分别为45mg/ml,23mg/ml,11mg/ml）作用后,其抑制率分别为 62.67±4.04%、21.33±1.53%、16.33±2.08%。在药物浓度为45mg/ml、23mg/ml时,免疫脂质体对生物膜的抑制作用优于脂质体和单纯的药物（所有P<0.05）,而脂质体对生物膜的抑制作用优于单纯的药物（所有P<0.05）。在药物浓度为11mg/ml时,ISMN免疫脂质体、ISMN脂质体和ISMN单纯的药物对生物膜的清除作用是一样的,差异没有统计学意义（所有P>0.05）。CLSM绿色荧光定量的分析结果与Alamar Blue实验结果相一致。结论ISMN靶向纳米颗粒的抗生物膜的效应均较同等药物浓度的ISMN纳米颗粒和ISMN强。药物浓度为45mg/ml的ISMN靶向纳米颗粒的抗生物膜效应最强。CLSM的扫描结果表明药物浓度为45mg/ml的ISMN靶向纳米颗粒可以将生物膜的结构彻底破坏。ISMN靶向纳米颗粒对金黄色葡萄球菌生物膜所造成的感染性疾病的治疗有广阔的应用前景。第四部分 单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒对慢性鼻-鼻窦炎金黄色葡萄球菌生物膜的作用目的通过建立慢性鼻-鼻窦炎动物模型,研究单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒对金黄色葡萄球菌生物膜相关鼻窦炎的作用。方法建立慢性鼻-鼻窦炎动物模型,CT确认建模成功,通过对上颌窦进行置管分别用45mg/ml的ISMN靶向纳米颗粒、45mg/ml的ISMN纳米颗粒和45mg/ml的ISMN来进行冲洗,建模的过程中在不同的时间点对兔的耳缘静脉进行采血,通过ELISA实验检测建模过程中及药物冲洗后体内炎症因子表达水平的变化。药物干预结束后,取兔上颌窦黏膜进行Realtime PCR来检测炎症因子mRNA水平的变化,以此来探讨ISMN靶向纳米颗粒对金黄色葡萄球菌生物膜相关鼻窦炎的作用。结果成功建立了慢性鼻-鼻窦炎动物模型,建模的方法简单且易于操作。Elisa结果显示45mg/ml ISMN免疫脂质体冲洗一周后（即第42天）血液中IL-4、IL-8、IL-17A和IFN-γ的水平与第35天相比均降低,差异有统计学意义（所有P<0.05）,45mg/ml ISMN免疫脂质体使血液中IL-4、IL-8、IL-17A和IFN-γ的水平的降低程度均优于单纯的脂质体和药物,差异有统计学意义（所有P<0.05）。Realtime PCR 结果显示 45mg/ml ISMN 免疫脂质体组 IL-4、IL-8、IL-17A 和 IFN-γmRNA表达水平与模型组相比,其水平显著降低（所有P<0.05）。与45mg/ml的ISMN药物组和45mg/ml ISMN脂质体相比,其水平也显著降低（所有P<0.05）。结论单硝酸异山梨酯靶向纳米颗粒可以清除生物膜降低体内炎症反应,为临床上难治性鼻窦炎的治疗提供了一种新的思路。