前列腺癌(prostate cancer)是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。前列腺癌的分类主要以病理为基础，分为腺鳞癌、尿路上皮癌、腺泡腺癌（腺癌）、鳞状细胞癌、导管腺癌。外周带的前列腺癌占70%以上，移行带的前列腺癌占约20%，仅仅5%位于前列腺中央带。在所有前列腺癌中，98%为腺癌，2%左右为鳞癌，因此，通常我们所说的前列腺癌就是指前列腺腺癌。前列腺癌在早期，由于肿瘤局限，大多数前列腺癌病人无明显症状，常在体检时偶然发现，也可在良性前列腺增生手术标本中发现。随着肿瘤不断发展，前列腺癌将会出现多种不同症状，主要有阻塞症状、局部浸润性症状、其他转移症状。阻塞症状表现为排尿困难、尿潴留、疼痛、血尿或尿失禁；局部浸润性症状表现为膀胱直肠间隙被累及，常有不适感，若肿瘤侵犯并压迫输精管还会引起患者腰痛以及患侧睾丸疼痛，部分患者还诉说射精疼；前列腺癌容易发生骨转移，开始可无病状，随着肿瘤的发展可引起神经压迫或病理骨折。　　前列腺癌主要通过实验室检查和其他辅助检查来诊断。大多数前列腺癌患者血清前列腺特异性抗原有明显升高，但约有30%的患者前列腺特异性抗原可能不升高，只是在正常范围内波动(正常范围＜4.0ng/ml)，联合直肠指诊会明显提高检出率。B超检查前列腺内可见低回声结节，CT或 MRI检查可显示前列腺形态改变、肿瘤及转移。前列腺癌的主要 CT表现为增强扫描时癌灶呈现增强不明显的低密度区，被膜显示不规则，腺体周围脂肪消失，精囊受侵犯后可表现出精囊境界模糊，膀胱精囊角消失或精囊增大；当肿瘤侵犯膀胱或前列腺周围器官时，盆腔 CT可观察淋巴结群的大小，判断有无转移发生。前列腺癌的MRI检查主要选用T2加权序列，在T2加权像上，高信号的前列腺外周带内出现低信号的缺损区、前列腺带状结构破坏、外周带与中央带界限消失。当然，前列腺穿刺活检作病理诊断是前列腺癌诊断的确诊方法，但需注意的是活检阴性不能否定诊断。　　从全球来看，前列腺癌发病率在不同国家和地区有着明显的差异。总的来说，欧美国家发病率较高，欧洲、北美洲、大洋洲等发病率远远高于世界其他地区；以人种划分来看，黑人发病率为最高，白人次之，黄种人发病率最低。2015年我国肿瘤登记地区前列腺癌发病率为60.3/10万，死亡率为26.6/10万，列男性恶性肿瘤发病率的第6位。统计数据显示，发病率随着年龄的增长而增长，55岁前人群的发病率较低，55岁后逐渐升高，高峰年龄在70～80岁。家族遗传型前列腺癌患者发病年龄稍早，年龄≤55岁的患者占43%。　　前列腺癌的治疗方法包括随访观察、经尿道前列腺切除、根治性前列腺切除、放射治疗、冷冻治疗、内分泌治疗、综合治疗等。根据患者的年龄、全身状况、各项检查以及所预测的前列腺癌临床分期、穿刺活检标本获得的肿瘤组织学分级、Gleason评分以及有无盆腔淋巴结转移灶和远处转移灶等因素决定具体治疗方案。大多数前列腺癌患者确诊时间较晚，临床上以内分泌治疗（去势治疗）为主，经过一段时间治疗后，病情可得到控制和改善，但后期大部分患者的病情往往进展为去势治疗抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC），预后不良。化疗是前列腺癌以及CRPC的主要治疗方式，但由于肿瘤的耐药性，在经过一段时间的化疗后往往出现肿瘤的反弹现象，因此，需要寻找新的治疗CRPC方式。　　程序性坏死（programmed necrosis）是一种受细胞内基因调控的细胞坏死形式，通过特异性配体与细胞膜上相应受体结合进而诱导程序性坏死的发生，它在胚胎发育和组织平衡中起着重要作用。与凋亡不同，程序性坏死是一种不能被广谱 caspase抑制剂抑制的细胞死亡。与程序性坏死相关的分子主要有丝氨酸苏氨酸激酶1受体相互作用蛋白（receptor-interacting serine/threonine protein kinase1，RIPK1）、丝氨酸苏氨酸激酶3受体相互作用蛋白（receptor-interacting serine/threonine protein kinase3，RIPK3）、凋亡相关因子配体（factor associated suicide ligand，FasL）、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）以及混合谱系激酶结构域样蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）。当细胞受到胞内或胞外因素影响而激活RIPK1,随后RIPK3、TRAIL、FasL激活，进而启动程序性坏死的核心分子MLKL，在细胞膜上形成孔道，导致离子流紊乱，细胞发生肿胀坏死，即程序性坏死。　　程序性坏死作为肿瘤细胞死亡的主要方式之一，目前研究认为，耐药肿瘤细胞有可能通过程序性坏死被清除，临床研究发现，肿瘤组织中高表达 MLKL的患者，其预后更好，生存期更长，故程序性坏死有望作为治疗耐药性肿瘤的新靶标。　　FasL与TRAIL均为死亡受体家族的配体，激活的FasL与TRAIL可与丝氨酸苏氨酸激酶1受体相互作用蛋白（RIPK1）结合，进一步磷酸化丝氨酸苏氨酸激酶3受体相互作用蛋白（RIPK3），激活MLKL蛋白，诱导细胞程序性坏死。　　FOXO3a为叉头转录因子O家族（forkhead transcription factor O，FOXO）中的一员。有研究提示 FOXO3a蛋白在细胞凋亡中起着关键的作用，使得其成为肿瘤治疗的潜在靶标。多项研究表明，FOXO3a可增加化疗药物的敏感性。在乳腺癌细胞及急性髓白血病细胞中，FOXO3a通过诱导细胞凋亡从而实现抗肿瘤效应。在新生小鼠卵巢中使FOXO3a过表达，可激活下游FasL和p27等凋亡因子，进而激活凋亡蛋白酶caspase3和caspase8，导致卵母细胞凋亡。FOXO3a可与DNA结合调控下游基因FasL及TRAIL的转录水平.另有报道指出，活化的FOXO3a通过TRAIL信号转导通路，参与人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染导致的记忆性B细胞的凋亡。因而，FOXO3a可能参与了肿瘤细胞的程序性坏死。　　桔梗皂苷D（platycodin D，PD）是来源于植物桔梗中的一种皂苷类单体化合物。以往研究证实其可通过多靶标多通路影响肿瘤细胞的增殖、生存、侵袭转移、凋亡及自噬等。本课题组的前期研究发现，PD抑制前列腺癌细胞生长且上调FOXO3a的表达，以PC3细胞（非雄激素依赖）最为敏感。同时AnnexinⅤ-FITC/PI染色显示PD诱导的死亡多为PI阳性，细胞膜发生损伤，细胞死亡为程序性坏死。　　为研究PD诱导前列腺癌PC3细胞死亡的方式及FOXO3a在其中的作用，本研究通过体外实验，以PC3细胞为研究对象，观察caspase抑制剂处理后PD对PC3细胞的影响及FOXO3a表达下降对PD诱导PC3细胞死亡的影响。同时，体内实验以裸鼠为研究对象，建立PC3细胞移植瘤模型，研究FOXO3a在PD抑制PC3细胞体内中的作用，为PD进一步作为前列腺癌治疗药物或辅助用药打下基础。　　实验方法：　　1.利用MTT法，观察PD对前列腺癌PC3细胞存活率的影响；　　2.凋亡抑制剂Z-VAD-FMK（广谱型caspase抑制剂）或ACDEVD-CHO（特异性针对caspase3抑制剂）预处理PC3细胞后，利用MTT法检测PC3细胞的存活率，以观察PD抑制PC3细胞生长是否有caspase非依赖机制参与；　　3.利用台盼蓝染色，观察PD处理PC3细胞后其形态学变化情况，了解PD是否引起PC3细胞坏死；　　4.利用乳酸脱氢酶释放实验，检测PD处理PC3细胞后LDH的释放情况，了解PD是否引起PC3细胞膜破坏，细胞坏死；　　5.利用蛋白质免疫印迹法，检测PD对PC3细胞中FOXO3a、FasL、TRAIL、Bim、MLKL、p-MLKL表达的影响，探明PD引起PC3细胞死亡是否有程序性坏死的机制参与；　　6.利用免疫荧光法检测FOXO3a在PC3细胞内定位的情况；　　7.利用FOXO3a-shRNA沉默FOXO3a基因，蛋白质免疫印迹法检测沉默效果，并采用MTT法、台盼蓝染色及LDH释放实验检测FOXO3a基因沉默后PD对PC3细胞存活率和细胞膜完整性的影响，探明PD引起PC3细胞死亡是否经由FOXO3a参与的程序性坏死机制参与；　　8.建立裸鼠移植瘤模型，研究PD在体内实验中对前列腺癌生长的影响及FOXO3a在其中的作用。　　实验结果：　　1.20μM PD可明显抑制前列腺癌PC3细胞生长；　　2.凋亡抑制剂Z-VAD-FMK与ACDEVD-CHO均不影响PC3细胞生长，且不能逆转PD对PC3细胞的抑制作用；　　3. PD处理的PC3细胞台盼蓝染色阳性率及LDH释放率高于对照组，细胞呈坏死样死亡；　　4.20μM PD上调p-MLKL蛋白表达，四聚体p-MLKL蛋白明显上调；　　5.20μM PD上调FOXO3a、FasL、TRAIL、Bim蛋白表达；　　6.20μM PD促进FOXO3a表达，且大多数表达于细胞核内；　　7. FOXO3a-shRNA沉默FOXO3a表达后，20μM PD处理的PC3细胞存活率提高，台盼蓝染色阳性率、LDH释放率降低；　　8.在裸鼠移植瘤模型中，PD能能通过FOXO3a抑制PC3细胞移植瘤的生长，2.5 mg/kg PD-MOCK组的肿瘤比MOCK组缩小约56%，而2.5 mg/kg PD-FOXO3a-shRNA组肿瘤比NC-shRNA组缩小约20%，且2.5 mg/kg PD-MOCK组的肿瘤比2.5 mg/kg PD-FOXO3a-shRNA组缩小约45%。同时在PD-MOCK组肿瘤组织中FOXO3a、FasL、TRAIL、Bim蛋白表达均上调，而PD-FOXO3a-shRNA组以上蛋白上调不明显。　　实验结论：　　PD可抑制前列腺癌PC3细胞生长，上调FOXO3a及其下游FasL、TRAIL、Bim蛋白表达，促进程序性坏死核心分子MLKL蛋白磷酸化并形成四聚体，诱导PC3细胞程序性坏死。在体内实验中，PD可以通过促进FOXO3a及其下游分子的表达抑制前列腺癌生长。PD通过 FOXO3a-FasL/TRAIL-MLKL通路诱导细胞程序性坏死，抑制裸鼠移植瘤的生长。