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目的:构建H37Ra Hsp16.3基因敲除菌株以及回补菌株,研究Hsp16.3在H37Ra菌株中的功能,并观察该基因敲除菌株对小鼠骨髓来源巨噬细胞炎性细胞因子表达,趋化功能以及抗原呈递功能的影响。方法:1.通过同源重组技术构建Hsp X基因敲除菌株(MUT);向MUT菌株电转化p MV261-Hsp X质粒构建Hsp X基因敲除回补菌株(COMP)。2.通过对比野生型菌株(WT)、COMP和MUT菌株的菌落特征和生长速率来观察Hsp16.3的缺失对H37Ra菌株的影响。3.构建体外WT、COMP和MUT菌株感染巨噬细胞的潜伏感染模型。在该模型构建成功后继续培养24h和48h,Real-time PCR检测巨噬细胞炎性细胞因子i NOS、IL-6和TNF-α基因表达水平,Western-blot检测i NOS的蛋白表达水平,ELISA检测IL-6和TNF-α蛋白表达水平。4.通过transwell实验检测Hsp16.3对巨噬细胞趋化功能的影响,Real-time PCR检测趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL12基因表达水平,FCM检测F4/80+CCR1+、F4/80+CCR2+和F4/80+CCR5+细胞数量。5.分别用WT、COMP及MUT菌株以MOI=2感染巨噬细胞,在1h时通过透射电镜观察菌株对吞噬体的影响;在24h时,通过透射电镜观察菌株对吞噬溶酶体膜的影响;在潜伏感染模型构建成功后,加入(或不加入)CD4+T细胞共培养48h,FCM检测在体外潜伏感染模型下F4/80+MHCⅡ+细胞数量,Western-blot检测MHCⅡ和CIITA表达变化,Real-time PCR检测PI、PIII及PIV的表达变化,ELISA检测上清液中IL-10和IFN-γ的表达。在潜伏感染模型构建成功后,加入终浓度为100ng/ml IFN-γ培养48h,FCM检测MHCⅡ类分子表达,Real-time PCR检测PI、PIII及PIV的基因表达变化。分别用WT、COMP及MUT菌株以MOI=2感染小鼠骨髓来源巨噬细胞感染3h后,在加入CD4+T细胞或终浓度为100ng/ml IFN-γ后30min、60min和3h后,Western-blot检测p-STAT1和p-STAT3的表达水平。6.潜伏感染模型构建成功后,加入或不加入CD4+T细胞共培养72h,检测WT、COMP及MUT菌株对巨噬细胞胞内杀伤功能的影响。结果:1.通过PCR鉴定和抗性平板筛选发现MUT菌株同源重组区构建成功,p MV261-Hsp X质粒成功转化入MUT菌株;Western-blot检测发现MUT菌株不表达Hsp16.3,而COMP菌株表达Hsp16.3。2.对比菌落特征发现WT、COMP和MUT菌株的菌落大小没有差异,WT和COMP菌株较MUT菌株有更多的索状突起,且在培养早期生长更快。3.Hsp16.3使巨噬细胞IL-6和TNF-α基因表达水平在感染后24h下调,使i NOS基因表达水平在感染后48h时上调(P<0.05)。Hsp16.3不影响IL-6、TNF-α和i NOS的蛋白表达水平。4.Hsp16.3抑制巨噬细胞趋化至transwell下室,使得趋化因子CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL12的基因表达下调(P<0.05),F4/80+CCR2+细胞和F4/80+CCR5+细胞数量下调(P<0.05),而对F4/80+CCR1+细胞数量没有影响。5.Hsp16.3对巨噬细胞吞噬体膜没有影响,而感染后24h,Hsp16.3的缺失使菌株对吞噬溶酶体膜的干扰更小,吞噬溶酶体膜更为完整。WT、COMP和MUT菌株均能使巨噬细胞MHCⅡ类分子表达下调,而不影响CIITA的表达。当加入CD4+T cell共培养后,Hsp16.3阻碍了巨噬细胞MHCⅡ类分子蛋白表达水平,CIITA蛋白表达水平和PIV基因表达水平的上调;上清液中,MUT菌株感染组IL-10的含量较WT菌株感染组和COMP菌株感染组下调(P<0.05),而IFN-γ的含量上调(P<0.05);当加入IFN-γ刺激后,Hsp16.3抑制了F4/80+MHCⅡ+细胞数量大幅度增加和PIV的基因表达水平上调(P<0.05)。在共培养CD4+T细胞后,Hsp16.3阻碍了巨噬细胞p-STAT1的表达上调(P<0.05),而未对p-STAT3的表达造成影响;在加入IFN-γ刺激后,Hsp16.3抑制了巨噬细胞p-STAT1和p-STAT3的表达上调(P<0.05)。6.在潜伏感染模型构建成功后继续培养72h,各菌株感染组之间CFU数量没有差别;而在潜伏感染模型构建成功后加入CD4+T细胞共培养72h,MUT菌株感染组CFU数量低于WT菌株感染组(P<0.001)以及COMP菌株感染组(P<0.01)。结论1.H37Ra Hsp X基因敲除菌株和H37Ra Hsp X基因回补菌株构建成功;2.MTB Hsp16.3可能是维持H37Ra菌株生长及抵御巨噬细胞杀伤的重要菌体蛋白;3.MTB Hsp16.3能在基因表达水平调控巨噬细胞炎性细胞因子IL-6、TNF-α和i NOS的表达;4.MTB Hsp16.3可抑制小鼠骨髓来源巨噬细胞趋化功能,可能是通过CCR5/CCL3_CCL4_CCL5和CCR2/CCL2_CCL12信号轴对巨噬细胞的趋化功能产生抑制作用;5.MTB Hsp16.3可能通过下调STAT1和STAT3的磷酸化而阻碍IFN-γ诱导的巨噬细胞MHCⅡ类分子的表达上调。