5-HETE引起人白血病K562细胞凋亡及其信号转导机制的研究

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研究主要从细胞形态学、流式细胞半定量及5-HETE对K562细胞损伤中细胞内促凋亡和抗凋亡基因改变等方面,考察了5-HETE对K562细胞引起的凋亡作用;观察5-HETE引起凋亡作用时K562细胞对酪氨酸磷酸化、MAPK途径中ERK磷酸化及P38 MAPK磷酸化等的变化;并应用酶氨酸蛋白激酶抑制剂genestein、P38 MAPK抑制剂SB2035809和MEK抑制剂PD098059观察5-HETE对K562细胞在磷酸化途径及MAPK途径上的作用,试图阐明5-HETE通过MAPK信号转导途径引起K562细胞凋亡的机制.该研究主要结果如下:1.5-HETE引起白血病K562细胞的凋亡:1.1采用四唑盐比色法测定5-HETE对K562细胞损伤时间在3h~24h之间、浓度在0.1~0.5μM、损伤时间为12h时能引起K562细胞损伤.1.2电镜观察损伤的形态学改变:与无5-HETE处理组对照,在5-HETE刺激下,K562呈现出典型的凋亡特征:细胞表面微绒毛消失,细胞质浓缩,细胞核变小,核染色质浓缩并凝结成块,出现染色质质沿核膜内侧排列的核着边现象,呈半月形凝集在核膜周边.1.3利用流式细胞仪进行定量分析发现,对照组细胞凋亡率为6%,而5-HETE损伤组的细胞凋亡率上升到22%,与对照组相比有显著性差异.1.4RT-PCR分析5-HETE引起K562细胞凋亡时,细胞内促凋亡基因和抗凋亡基因的改变.2.5-HETE引起K562细胞凋亡的MAPK途径研究:2.1 5-HETE对酪氨酸磷酸化的作用:与空白相比,在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min时,酪氨酸磷酸蛋白的表达在1min~10min呈时间依赖性地减少,在10min时达到最低;2.2 5-HETE对ERK磷酸化的作用:在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min时,ERK磷酸化蛋白的表达呈时间依赖性地减少;在ERK磷酸化的长时间作用中,5-HETE损伤组在24h时蛋白的表达量最低;2.3 5-HETE对P38磷酸化的作用:与空白组相比,在加入5-HETE 1min、5min、10min、30minT 60min时,30min蛋白的表达量最低;3.应用酪氨酸激酶抑制剂genestein、P38 MAPK抑制剂SB2035809和MEK抑制剂PD098059,分别观察对5-HETE引起K562凋亡作用的影响:3.1 5-HETE损伤组引起K562细胞细胞色素C释放增加、caspase 3、8和释放增加;3.2 应用P38 MAPK 抑制剂SB203580时,与5-HETE损伤组相比,抗凋亡基因bcl-2的表达增加、caspase家族中caspase3和caspase9的表达减少;3.3 应用MEK抑制剂PD098059,与5-HETE损伤组相比,抗凋亡基因bcl-2的表达增加,caspase3的表达没有显著差异.3.4 应用酪氨激酶抑制剂genstein的处理组中,细胞色素C的释放与5-HETE损伤组相比显著减少caspase3、caspase8和caspase9的表达与5-HETE损伤组没有显著性差异.3.5 三种抑制剂能分别对抗5-HETE引起的K562细胞存活率的降低;以上实验结果表明:5-HETE在白血病K562细胞的凋亡中起着重要作用.根据这些结果,我们认为5-HETE通过减少酪氨酸磷酸化及MAPK途径中P38磷酸化、ERK磷酸化作用,激活细胞色素C自线粒体释放至胞质,促使胞质细胞色素C对caspase蛋白酶的激活从而导致K562细胞凋亡.作为酪氨酸激酶抑制剂的genestein、P38 MAPK抑制剂和MEK抑制剂的SB203580和PD098059,能通过它们各自的抑制途径,5-HETE引起的凋亡.上述结果提示:5-HETE通过MAPK途径促使白血病K562细胞凋亡的作用对于解释肿瘤细胞发生、凋亡的可能机制具有一定意义;为发现潜在药物作用对于解释肿瘤细胞发生、凋亡的可能机制具有一定意义;为发现潜在药物作用靶点提供了一定的理论依据.
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