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肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)是骨骼肌生长发育的负调控因子，其与肌纤维细胞的生长和数量密切相关。MSTN基因的缺失会造成肌肉过度肥大的现象，即所谓的“双肌”现象，“双肌”牛较普通牛产肉率可提高40％左右，但通过常规杂交育种培育“双肌”牛，其育种周期长，遗传性状不稳定，而通过基因打靶技术结合体细胞核移植(Somaticcellnucleartransfer，SCNT)技术可克服此缺点。本实验对牛胎儿成纤维细胞转染条件进行优化，利用锌指核酶打靶载体对其进行转染，经PCR产物测序鉴定MSTN敲除的阳性克隆细胞系，为MSTN基因功能的研究以及后续MSTN敲除牛的生产奠定基础。 1、牛胎儿成纤维细胞转染条件的优化 利用增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1质粒，对电穿孔法及脂质体法转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞的转染条件进行优化，转染48h后，经流式细胞仪分析，最高转染率分别为35.02±3.51％和44.06±0.30％，对应的转染条件分别为500v电压、4ms脉冲时间、3ug质粒和2ul脂质体、800ng质粒，相差显微镜下观察，细胞状态良好，统计学分析两者无显著性差异(P＞0.05)。 2、利用锌指核酶技术制备MSTN基因敲除的牛胎儿成纤维细胞 通过优化的转染条件，将购于Sigma-Aldrich公司的两套锌指核酶载体bMK-Ⅰ（包括bZFN-1、bZFN-2两个质粒）和bMK-Ⅱ（包括bZFN-3、bZFN-4两个质粒）分别导入鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中，随机挑取单细胞，建立单克隆细胞系，使用跨锌指核酶作用位点的PCR引物对单克隆细胞系基因组进行PCR扩增，PCR产物测序鉴定后，最终得到在锌指核酶作用位点发生突变的单克隆细胞系。由电穿孔法介导打靶一次，获得154个单克隆细胞系，其中有1个单等位基因突变的阳性单克隆细胞系，打靶效率为6.5‰;由脂质体法介导打靶两次，第一次获得83个单克隆细胞系，其中有2个单等位基因突变的阳性单克隆细胞系，第二次获得316个单克隆细胞系，其中有12个单等位基因突变的阳性单克隆细胞系和1个双等位基因突变的阳性单克隆细胞系，打靶效率为3.8％。相比于电穿孔法，采用脂质体法将锌指核酶导入鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，更有利于阳性细胞系的制备。