论文部分内容阅读
目的:内皮抑素是近几年发现的一种内源性血管内皮细胞增殖的强效抑制剂。研究发现内皮抑素能特异性抑制处于增殖状态的新生血管内皮细胞,并伴有诱导凋亡的作用。然而最近的Ⅰ期临床试验研究结果表明,内皮抑素体内半衰期短,生物利用度低。如果能够通过一定的手段提高其生物利用度、延长其体内半衰期以减少给药剂量或延长给药周期,将会大大提高内皮抑素的治疗效果,促进其在临床上的应用。本课题将运用低分子肝素对内皮抑素进行结构修饰,并重点观察低分子肝素化内皮抑素抑制碱烧伤诱导的兔角膜新生血管（CNV）的效果,探讨其作用机制。 方法: 1.内皮抑素的分离纯化 取含内皮抑素基因毕赤酵母菌表达上清液,经纤维素交换剂CM-Ⅱ离子交换层析柱和Sephadex G-50凝胶过滤层析柱,分离纯化得到电泳单点纯的内皮抑素,并通过MTT比色法测定了其抑制人脐静脉内皮细胞（HEUCV）增殖的活性。 2.LMWH对内皮抑素的修饰 采用高碘酸氧化法活化LMWH,制得的LMWH活化液于pH 9.5、0.3mol/L的NaCO-NaHCO3缓冲液中对内皮抑素进行化学修饰。通过SDS-PAGE电泳监测修饰反应过程,比较不同时间点修饰液的自由氨基修饰率、活性保留百分率以及比较电泳监测结果确定LMWH修饰内皮抑素的修饰时间为48h。将修饰反应液经预处理后,使用Sephadex G-50凝胶过滤层析柱进行分离纯化,并进行了电泳鉴定。监测内皮抑素及LMWH-ES在25℃和37℃水浴中的热稳定性,发现修饰后的内皮抑素较未修饰的热稳定性有明显的提高。 3.低分子肝素化内皮抑素对兔角膜新生血管的抑制作用 取新西兰白兔30只,将浸有1mol/L氢氧化钠滤纸片置于兔角膜中央,制成