第一章白细胞介素-8（IL-8）基因过表达慢病毒载体构建摘要：目的：冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）是威胁中国公众健康的重要疾病。研究发现,冠心病患者产生的冠状动脉侧支循环（CCC）,有利于维持心肌活力,保护心功能。大量的动物实验证实了VEGF、bFGF等促血管生长因子蛋白和基因（质粒、腺病毒）应用于缺血心肌可促进缺血区侧支血管生长,代偿性替补供血血管,增加缺血心肌灌注,减小梗死面积,改善心功能。早期研究发现IL-8在炎症中起重要作用,随着对IL-8及其受体生物学活性和作用机制研究的深入,发现它还具有促有丝分裂与血管生成的作用,但IL-8是否具有促进心肌缺血区侧支血管生长,增加缺血心肌灌注未见有文献报道。本实验拟构建IL-8基因过表达慢病毒载体,为研究IL-8在缺血心肌血管新生中的作用奠定基础。方法：从购买的cDNA文库中,利用PCR方法钓取IL-8目的基因。将IL-8目的基因与酶切线性化的慢病毒载体进行定向交换,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的目的质粒。然后将构建好的融合蛋白表达载体进行超纯去内毒素抽提,抽提后与两种辅助包装原件载体,共转染293T细胞,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。结果：1.通过PCR扩增人IL-8基因完整的DNA序列,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,得到343bp的扩增产物为IL-8基因。2.IL-8目的基因与酶切线性化的慢病毒载体进行定向交换,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定,阳性转化子得到507bp的条带,阴性转化子得到198bp的条带,目的基因大小为507bp-198bp=309bp。将阳性克隆送Invitrogen公司测序,测序比对结果显示：Identities=298/298（100%）,测序结果与目标序列（IL-8）完全一致。3_哿所制备的各DNA溶液（pGC-FU-IL8-EGFP载体20μg, pHelper1.0载体15μg, pHelper2.0载体10μg）共转染293T细胞,24-48h后在荧光显微镜下观察可观察到绿色荧光。并进行Western blot （WB）检测,得到约39KD的条带,为IL-8与GFP融合表达的条带。4.病毒收获及浓缩后,Real time定量PCR法测定滴度,病毒滴度为2.00E+8TU/ml。结论：本实验成功构建IL-8基因过表达慢病毒载体,并在293T细胞中成功包装,包装后检测病毒滴度为2.00E+8TU/ml,为进一步研究IL-8在家兔缺血心肌血管新生中的作用奠定了基础。第二章慢病毒介导的IL-8表达对兔缺血心肌血管新生的影响及机制研究摘要：目的：IL-8是一种多源的细胞因子,多种细胞如内皮细胞、单核细胞、成纤维细胞、人类多种肿瘤细胞等均可合成和分泌IL-8。研究发现IL-8不仅在炎症中起重要作用,还发现它具有促有丝分裂与血管生成的作用。多项研究发现冠心病患者血液中IL-8浓度明显高于正常人,IL-8参与冠心病的发生发展过程,而且有研究发现,严重冠状动脉粥样硬化的心脏病病人,随着冠状动脉侧支循环（CCC）分级与评分的升高,病人血清IL-8及MMP-9浓度也相应地升高。但IL-8是否可促进心肌缺血区侧支血管生成及可能机制,均有待进一步研究。本实验拟在构建IL-8基因过表达慢病毒载体基础上,以兔心肌梗死为模型,将IL-8基因过表达慢病毒载体局部注射于梗死边缘区,分析IL-8能否促进冠状动脉侧支循环的建立及其可能机制。方法：选用健康清洁级中国家兔40只,随机分为4组：假手术组、心肌梗死模型组、心肌梗死+空质粒组、心肌梗死+IL-8质粒组。结扎冠状动脉左前降支近段制作家兔心肌梗死模型。分别于术前、造模时、造模后30分钟进行心电图检测,动态观察心电图变化。模型建立后1周、6周行超声心动图检查,了解心功能变化。采用H.E染色,观测心肌组织不同区域的组织形态学变化；GFP荧光照相检测转染情况；采用免疫组化染色,检测心肌梗死边缘区新生血管的密度。采用Westernblot法检测缺血心肌局部IL-8、磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表达情况。结果：1.造模动物40只,造模成功并存活至实验终点（造模术后6周）32只,每组各存活8只。2.造模术中所见、心电图变化、心脏大体观测及病理染色证实兔心肌梗死模型造模成功。荧光显微镜下观察缺血心肌局部可见绿色荧光,表明GFP标记的IL-8慢病毒质粒或空质粒转染至缺血心肌局部,假手术组和心梗对照组未见绿色荧光。3.与假手术组比较,心梗模型组IL-8的表达明显增加（P<0.01）；与心梗模型组比较,IL-8慢病毒质粒组IL-8的表达明显增加（P<0.01）,表明IL-8慢病毒质粒成功转染至局部缺血心肌。空质粒组与心梗模型组比较IL-8的表达无明显差别（P>0.05）4.与假手术组比较,心梗模型组术后1周、6周心功能明显下降,有统计学意义（P<0.01）；与心梗模型组比较,空质粒组术后1周、6周心功能无明显差异（P>0.05）；与心梗模型组比较,术后1周IL-8质粒转染组心功能未见改善,术后6周IL-8质粒转染组LVEDd,LVESd减低,LVFS,LVEF增加,示心功能有所改善,但差异无统计学意义（P>0.05）。5.与假手术组比较,心梗模型组心肌梗死边缘区新生血管密度明显增加,有显著性差异（P<0.01）；与心梗模型组比较,IL-8质粒组心肌梗死边缘区新生血管密度明显增加,有显著性差异（P<0.01）；但空质粒组与心梗模型组相比新生血管密度无显著性差异（P>0.05）。6.与假手术组比较,心梗6周后,心梗模型组梗死边缘局部心肌磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表达明显增加（P<0.01）；与心梗模型组比较,IL-8质粒组缺血局部心肌磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表达进一步增加（P<0.01）；但空质粒组与心梗模型组比较,二者的表达无显著性差异（P>0.05）。结论：1.成功构建急性心肌梗死兔模型,并成功将已制备的IL-8慢病毒质粒转染至缺血心肌局部。2.IL-8可促进心肌缺血区新血管生成,即促进侧支血管形成,机制可能与其Akt的磷酸化、GSK-3βser9的磷酸化有关。第三章IL-8对缺氧脐静脉内皮细胞增殖、凋亡的影响及机制研究摘要：目的：内皮细胞是覆衬于全身血管和淋巴管内面的单层扁平细胞,具有多种生理功能。它作为组织与血液间的第一道屏障,是最先感受缺氧的细胞之一。内皮细胞在血管新生中扮演主要的角色,在条件和环境变化时,内皮细胞由静止期转化为分裂期,使其分裂增殖导致血管新生。研究发现诱导内皮细胞凋亡会抵消其增殖,从而抑制了血管新生并导致血管的衰退,抑制内皮细胞凋亡可以促进血管新生。本部分制备缺氧的脐静脉内皮细胞分析IL-8对缺氧脐静脉内皮细胞增殖、凋亡的影响及其可能机制。方法：用不同浓度的CoCl2（50、100、200、400μmol/L）培养HUVECs12、24、48h, MTT比色法分析细胞存活率,选择合适浓度CoCl₂制备缺氧HUVECs;用不同浓度的Recombinant Human IL-8（1、10、50、100ng/ml）培养缺氧HUVECs, MTT比色法分析细胞存活率,选择合适浓度及时间点进行下一步的机制研究。取正常HUVECs及缺氧HUVECs,分别加入Recombinant Human IL-8（lOng/ml）、 Anti-IL-8（10μg/ml）、LY294002（20μmol/L）处理细胞48h后,MTT比色法分析细胞存活率,Annexin V/PI法检测脐静脉内皮细胞的凋亡,采用Western blot法检测磷酸化AKT、磷酸化GSK-3β^ser9Caspase3蛋白的表达。结果：1.不同浓度CoCl₂处理HUVECs12h,低浓度COCl2（50,100μmol/L）有促进细胞增殖的作用（P<0.01）,高浓度CoCl2（200,400μmol/L）无明显作用；处理24h,低浓度CoCl2（50μmol/L）有促进细胞增殖的作用（P<0.01）,高浓度CoCl2（200,400μmol/L）抑制细胞增殖（P<0.01）；处理48h,低浓度CoCl2（50,100μmol/L）无明显作用,高浓度CoCl2（200,400μmol/L）明显抑制细胞增殖（P<0.01）。2. IL-8（1,10,50,100ng/m1）处理缺氧HUVECs孵育24h,可改善缺氧所致的HUVECs增殖的抑制作用,但没达到统计学差异。处理48h、72h后,1ng/ml IL-8可改善缺氧所致的HUVECs增殖的抑制作用,但没达到统计学差异；10,50,100ng/ml可明显改善缺氧所致的HUVECs增殖的抑制作用,表现出促细胞增殖能力（P<0.01）。3.在正常HUVECs组中,与对照组比较,IL-8（10ng/ml）可明显促进HUVECs增殖,抑制HUVECs凋亡,LY294002（20μM）或IL-8抗体（10μg/ml）明显抑制IL-8的促细胞增殖作用,拮抗IL-8的抑制细胞凋亡作用（P<0.01）。在缺氧HUVECs组中,与正常对照组比较,缺氧组细胞存活率明显下降,凋亡明显增加（P<0.01）；与缺氧组相比,IL-8（10ng/m1）可明显促进缺氧HUVECs增殖,抑制缺氧HUVECs凋亡,LY294002（20μM）或IL-8抗体（10μg/ml）明显抑制IL-8的促细胞增殖作用,拮抗IL-8的抑制细胞凋亡作用（P<0.01）。4.与正常对照组比较,缺氧组磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表达明显下降,Caspase3的表达明显增强（P<0.01）。在正常HUVECs组中,与正常对照组比较,IL-8（10ng/ml）可明显上调磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表达,下调Caspase3的表达,LY294002（20μM）或IL-8抗体（101μg/m1）明显抑制IL-8对正常HUVECs磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9表达上调作用,拮抗IL-8对正常HUVECs Caspase3表达的下调作用（P<0.01）。在缺氧]HUVECs组中,与缺氧组比较,IL-8（10ng/ml）可明显上调磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9的表达,下调Caspase3的表达,LY294002（20pM）或IL-8抗体（10μg/m1）明显抑制IL-8对缺氧HUVECs磷酸化Akt、磷酸化GSK-3βser9表达上调作用（P<0.01）,拮抗IL-8对缺氧HUVECs Caspase3表达的下调作用（P<0.01）。结论：COC12诱导的缺氧条件下,IL-8能促进人类缺氧脐静脉内皮细胞增殖、抑制其凋亡,其机制与其促进Akt的磷酸化、GSK-3βser9磷酸化以及减少Caspase3的表达有关。