铜是植物生长发育所必需的微量营养元素,但是过量的铜对植物具有毒害作用。植物在适应环境的过程中逐渐形成了一系列对重金属的耐性机制,如螯合、区室化和排斥等。水稻(Oryza sativa L.)是世界上许多国家主要的粮食作物,也是单子叶模式植物。本论文以本实验室筛选和鉴定的耐铜水稻品种B1139和敏铜水稻品种B1195为试验材料,采用水培方式,运用双向电泳、固定化金属亲和层析、MALDI-TOF/TOF MS和蛋白溶液金属离子移除技术研究了铜胁迫对水稻幼苗根总蛋白质组和铜结合蛋白质组的影响,为进一步阐明植物的重金属耐性机制提供理论基础。样品制备是影响双向电泳图谱分辨率和重复性的重要因素。在铜胁迫下,由于水稻根蛋白中含有较多的铜离子及次生代谢物,很难去除,因此需要对蛋白提取方法进行优化。优化的TCA/丙酮提取方法(方法B)获得高分辨率的电泳图谱,蛋白点数由原来的(方法A)283个增加到862个。而酚提取方法优化前后的分辨率都较高,但优化后的方法(方法D)蛋白点数由239增加到了659个。综合蛋白点在等电点和分子量范围的分布和总蛋白点数来看,优化的TCA/丙酮方法(方法B),因蛋白点多、分布均匀和分辨率高,更适合用于重金属胁迫水稻根蛋白质组学研究。等电聚焦过程增加的两步除盐可以显著增加了2-DE的分辨率。将催芽后的水稻种子在木村B营养液中培养7d,然后用8 μg·mL-1 Cu2+处理水稻幼苗三天,以生长在完全营养液中的幼苗为对照(8μg·mL-1 Cu2)。用TCA/丙酮沉淀法对水稻幼苗根总蛋白进行提取,然后用双向电泳进行分离,银染胶经PDQuest软件分析。8 μmol L-1 Cu2+处理的水稻幼苗与对照相比,至少在一个品种中显著差异表达(1.5倍以上差异变化)的蛋白点有34个。用MALDI-TOF MS和肽质量指纹(PMF)对这些差异表达蛋白点进行鉴定,根据它们的功能特点,这些蛋白可分为有关抗氧化防御、氧化还原调控、胁迫响应、硫和谷胱甘肽代谢、碳代谢和信号转导的蛋白及其它蛋白。24个蛋白点在两个品种中同时上调,其中有9个蛋白点在B1139中的变化倍数显著高于B1195,它们分别是推测的半胱氨酸合酶、推测的丝氨酸乙酰转移酶3、推测的甘露聚糖endo-1,4-beta甘露糖苷酶7、L-抗坏血酸过氧化物酶1(spot 18)、推测的谷胱甘肽转硫酶2、推测的蛋白质磷酸酶2C 30、推测的CC-NBS-LRR抗性蛋白MLA13、类硫氧还蛋白3-3和育性恢复蛋白Rfl。在铜胁迫下,果糖激酶2和L-抗坏血酸过氧化物酶1(spot 16)在B1139中显著上调,而在B1195中轻微下调。推测的谷胱甘肽转硫酶(spot 29)在B1139中被显著诱导,而在B1195中没有出现。在铜胁迫下,这些在B1139中丰度增加倍数显著高于B1195或新出现的蛋白可能在水稻耐铜品种B1139对铜耐性中发挥重要作用。为了更好的理解植物对重金属的响应机制,这些蛋白在植物耐重金属中的作用还需要进行深入研究。由于蛋白质中的半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸残基对二价金属离子有很高的亲和力,许多铜结合蛋白在维持细胞内铜离子的稳态中发挥重要作用。利用固定金属亲和层析技术和蛋白质组技术对水稻根铜结合蛋白进行差异表达分析。但在铜胁迫下,植物细胞的某些铜结合蛋白因铜结合位点可能已与铜结合,而没有可用的位点再与固定化金属亲和层析柱上的铜结合,从而导致有些铜结合蛋白不能被分离或分离不完全。这就需要在进行固定金属亲和层析前,对蛋白质溶液中的金属离子进行去除,以增加铜结合蛋白的纯化效率。我们将自己合成的Sepharose-EDDS、TED及商品化的Sepharose-IDA、NTA进行比较,结果显示4种介质对铜的去除效果都很好,能去除95%以上的铜,尤以Sepharose-EDDS效果最好；连接IDA、NTA和EDDS交联琼脂糖介质能去除蛋白中90%以上的Zn；连接NTA和EDDS的对Mn的去除效果较好,能去除蛋白中90%以上的Mn。连接IDA 和 EDDS的交联琼脂糖介质能分别去除90和93%的Cd。以上分析可以看出,Sepharose-EDDS对蛋白中的Cu、Zn、Mn和Cd的去除效果都很好,可去除93%以上的以上重金属离子。由于Sepharose-EDDS可以同时高效地去除以上四种重金属,所以可应用于几种重金属复合污染植物蛋白研究的重金属离子去除。随后我们将连有EDDS和IDA的Sepharose用于铜结合蛋白的分离纯化中。结果表明,去除蛋白中的金属离子可显著地增加了铜结合蛋白的洗脱峰峰面积,而且后者的特异性铜结合蛋白的峰面积显著高于前者。随后我们对用Sepharose-IDA去金属前后的铜结合蛋白进行了2-DE分析。结果表明,与提取的蛋白直接进行Cu-IMAC相比,用Sepharose-IDA去金属后再进行Cu-IMAC,显著增加了38个蛋白点的丰度。随机选取其中13个蛋白点进行质谱鉴定,发现12个蛋白点含有Smith等推测的铜结合motif。咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶虽然不含有预测的motif,但晶体结构分析表明它含有保守的金属结合位点。应用固定金属亲和层析技术和蛋白质组学技术对铜胁迫诱导的水稻根铜结合蛋白进行差异表达鉴定。与对照相比,铜胁迫显著增加了两个水稻品种根特异性铜结合蛋白的丰度,且B1139的增加显著高于B1195。两个品种水稻根蛋白经Cu-IMAC分离铜结合蛋白,然后经2-DE、MALDI-TOF/TOF MS鉴定差异表达的铜结合蛋白。与对照(0.32μmol L-1 Cu2+)相比,8μmol L-1 Cu2+处理的水稻根,有35个蛋白点至少在一个水稻品种中显著差异表达(1.5倍以上差异变化)。在两个品种中都上调的蛋白点18个,都下调的蛋白点3个(spots 30、31和32)。在两个品种中都上调的蛋白点中,有7个蛋白点在B1139中变化倍数显著高于B1195,如推测的过氧化物酶、类富含CHP的锌指蛋白、谷胱甘肽转硫酶II和PR(Bet v I)。而有4个蛋白点在B1195中上调倍数显著高于B1139,包括Cu/Zn-SOD、类萌发素蛋白6和谷氨酰胺合成酶同工酶(茎)等。推测的PR、PR-10a、推测的遍在蛋白交联酶spm2和推测的冷激蛋白1等6个蛋白在B1139中被显著诱导表达,而在B1195中却没有探测到。在B1139中显著上调,而在B1195中不变的蛋白4个,它们分别是甲硫氨酸亚砜还原酶A 2-1、钙结合蛋白、推测的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶1和外被体蛋白I Epsilon亚基。谷氨酰胺合成酶同工酶(茎)(Spots 11)和推测的谷氨酰胺合成酶同工酶(根)(spot 12)在B1139中下调,但在B1195的处理和对照中都没有发现。在两个水稻品种中都下调的蛋白点3个,它们在B1139的对照和处理中的丰度都分别显著高于B1195,都属于蛋白翻译起始因子5A。铜结合蛋白差异表达分析结果显示,10个蛋白仅仅在耐铜水稻品种中被显著诱导,7个蛋白在耐铜水稻品种中上调的倍数显著高于敏铜品种。这些蛋白包括抗氧化和解毒相关蛋白、基因转录调控相关蛋白、病程相关蛋白、有关细胞壁木质素合成的酶和有关信号分子的蛋白等。这些铜结合蛋白可能在水稻耐铜品种对铜耐性中发挥重要作用。