丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是一种有包膜的单正链RNA病毒，隶属于黄病毒科，丙型肝炎病毒属；主要经血传播，是引起急、慢性肝炎的重要病原体之一。HCV感染是一个全球性的公共卫生问题，目前全球HCV感染者约为1.6亿，每年新增感染者约有二百万。高达80%的HCV感染者发展为慢性感染，HCV慢性感染是引起肝硬化、肝细胞癌的重要原因之一。此外，HCV慢性感染还与多种肝外疾病，如糖尿病、淋巴瘤、肾小球肾炎、混合性冷球蛋白血等症相关。HCV RNA聚合酶无校对功能，致使其基因组在复制过程中易产生突变。根据基因组核苷酸序列的异质性，HCV被分为7个不同的基因型，每个基因型又被分为若干亚型。受各蛋白在HCV复制周期中功能的限制，HCV基因组中的变异呈现明显的不平衡分布。HCV各蛋白中，以包膜蛋白的变异性最高，这由包膜蛋白是诱导中和抗体的靶抗原的特性所决定。HCV包膜蛋白由E1和E2两个亚基通过非共价键形成异源二聚体所构成，其中位于E2氨基末端的27个氨基酸残基是包膜蛋白中变异频率最高的区域，该区域被称为高变区1（hypervariableregion1, HVR1）。HVR1是最早发现的HCV中和表位所在区域，该区域的变异被认为是HCV免疫逃逸和持续感染的重要原因，也是丙肝疫苗研发一直面临的瓶颈。HVR1高度暴露于HCV包膜蛋白的表面，是病毒与B类I型清道夫受体（scavenger receptor class B type I, SR BI）作用的关键区域，高密度脂蛋白（HDL）增强HCV的细胞侵入依赖于HVR1的存在，因而HVR1在HCV的细胞入侵过程中起重要作用。HCV患者外周血以及细胞培养体系中的HCV颗粒表面均不同程度结合有脂蛋白，这使得HCV颗粒呈现低密度特性以及明显的密度不均一性。HCV颗粒的感染性与其密度负相关，这提示HCV颗粒表面结合的脂蛋白有助于增强HCV的感染性。最近有研究显示，HVR1参与调节HCV颗粒与脂蛋白的结合，从而影响HCV的感染性与逃逸中和免疫。综上，HVR1在HCV的感染和免疫逃逸中起重要调控作用。我们前期在1a型的H77株，1b型的Con1株HCV包膜蛋白的HVR1中均分别鉴定出三个相对独立的不同微功能域：感染决定区，决定HCV包膜蛋白与SR BI受体的结合，该区的缺失导致HCV假病毒颗粒（HCV pseudotyped particles, HCVpp）的感染性彻底丧失，缺失该区的单个氨基酸残基能降低HCVpp感染性的70%以上，但单个氨基酸残基的替换突变并不明显改变HCVpp的感染性；感染调节区，删除该区域仅有限降低HCVpp的感染性，该区域内的突变可改变HCVpp的感染性；多功能区，为HVR1中的中和表位，删除该区增强或有限降低HCVpp的感染性，但消除了HDL对HCV细胞入侵的增强作用以及肝素与E2的结合活性，并增强E2抗体的中和活性。本研究中，我们根据H77原型株HCV患者血清HVR1序列历经13年以后的变异情况对我们上述的HVR1功能分区进行再次评价，并用细胞培养来源的HCV（HCV derived from cell culture, HCVcc）为模型进一步探讨多功能区，即中和表位的其他功能，本研究结果推进了对HCV逃避体液免疫应答机制的认识，并为HCV疫苗的研发提供了新思路。第一部分H77株HCV HVR1间隔13年后的序列变异对其功能的影响美国NIH Purcell教授对一名于1977年初次诊断为经血传播的非甲非乙型肝炎患者（后证实是HCV感染）在急性期以及慢性期多个时间点的HCV基因进行了克隆和测序，使该患者的血清序列成为HCV变异、中和免疫等研究的经典材料。前期我们以该患者1977年急性期的E1E2序列（H77株）中的HVR1进行的功能研究显示，在该株病毒的HVR1中存在三个相对独立的微功能域；本研究中，我们分析了该患者历经13年以后，即1990年从该患者血清扩增出的E1E2（H90株）中HVR1序列变异对其免疫原性和包装出的HCVpp感染性的影响。比较H77株的HVR1序列（ETHVTGGSAG HTTAGLVGLLTPGAKQN）与H90株HVR1序列（ETHVTGGSAG HSVLGIASFLTRGPKQN），发现共有9个氨基酸（aa1214、aa1619、aa22、aa24）发生了突变。我们在H77株E1E2序列中分别引入三种突变：突变1，将H90株HVR1的aa1214引入H77株HVR1；突变2，将H90株HVR1的aa1619、aa22及aa24引入H77株HVR1；突变3，将H90株HVR1的全部9个氨基酸突变引入H77株HVR1。比较三种HVR1突变的E1E2与H77株原型E1E2在293T细胞内的表达水平、组装产生假病毒颗粒的效率、HCVpp的感染性以及H77株HVR1抗体对各假病毒的中和活性。分别将三种突变质粒与H77株E1E2质粒转染293T细胞，Western blot检测显示HVR1突变的E1E2与H77株E1E2的表达水平无明显差异，组装产生假病毒颗粒的效率相似，但各假病毒的感染性及H77HVR1抗体对各假病毒的中和活性各异。由突变质粒1转染293T细胞而制备的HCVpp的感染性为H77株的70%，其感染性能被H77株HVR1抗体中和；由突变质粒2转染制备的HCVpp的感染性为H77株的140%，H77株HVR1抗体对其无中和活性；由突变质粒3转染制备的HCVpp的感染性为H77株的90%，H77株HVR1抗体对其无中和活性。前期研究中，我们在H77HVR1中鉴定出aa113为感染调节区，删除该区的氨基酸残基仅部分影响HCVpp的感染性；aa1415以及aa2527共同组成感染决定区，删除该区的氨基酸残基显著降低HCVpp的感染性，但该区的点突变仅有限降低HCVpp的感染性；aa1624为中和表位，也称为多功能区。本部分实验中的突变1对H77HVR1的aa1214进行了突变，这三个点突变均位于先前鉴定出的中和表位以外，其中aa12和aa13位于我们先前鉴定出的感染调节区，aa14位于感染决定区，突变1相应HCVpp的感染性仅部分降低，且能被H77HVR1抗体中和；突变质粒2中的6个点突变均位于HVR1中和表位中，相应HCVpp的感染性明显增强，且不能被H77HVR1抗体中和；突变质粒3含有H90HVR1的全部9个点突变，对应HCVpp的感染性为H77的90%，且也不能被H77HVR1抗体中和。此外，H90株HVR1抗体能中和突变2和突变3对应HCVpp的感染，但不能中和H77及突变1对应HCVpp的感染。这些结果均与我们先前鉴定的H77HVR1三个微域各自的功能相符。H90株HVR1序列的变异提示HVR1在进化过程中体现了各位点残基变异的随机性与维持HVR1介导免疫逃避与细胞侵入的协调统一。第二部分HVR1中和表位对HCV密度以及感染特性的影响用HCVpp为模型我们观察到HVR1中的中和表位是HDL增强HCV感染性的关键结构域，并且能保护HCV抵制E2抗体的中和作用，由此可见该区域在HCV免疫逃逸中发挥重要作用。HCVpp由293T细胞产生，其表面没有脂蛋白，与真正HCV病毒颗粒的细胞侵入特性并不完全相同，本部分的研究中，我们用HCVcc模型验证在HCVpp模型上获得的结果，并进一步观察该表位对HCV颗粒细胞侵入特性的影响。我们分别制备了删除HVR1和HVR1中和表位的J6/JFH1嵌合株HCVcc，结果显示两种缺失突变的HCVcc的感染性均下降为野生型的10%左右，且这两种突变HCVcc的感染性分布和密度分布呈现出十分相似的趋势，感染性病毒颗粒的分布均向高密度层偏移，且HDL对两种突变HCVcc的感染性均不产生影响。此前已有报道完全删除HVR1导致低密度HCVcc的分布下调以及高密度HCVcc的感染性上调，那么，仅删除中和表位引起HCV密度和感染性发生类似改变的机制何在？我们通过密度梯度离心分离出J6/JFH1嵌合HCVcc的低密度与高密度颗粒，观察HDL对不同密度颗粒感染性的影响，结果显示HDL不影响低密度HCVcc颗粒的感染性，但增强高密度HCVcc颗粒的感染性。分别检测HVR1多克隆抗体以及针对E2蛋白中HVR1以外区域（E2HVR1）的多克隆抗体对不同密度病毒的中和活性，结果显示，HVR1抗体对低密度HCV颗粒的中和活性强于对高密度颗粒的中和活性。与此相反，E2HVR1抗体对高密度病毒的中和活性高于对低密度病毒的中和活性。用HCV受体SR BI和CD81的多抗进行感染阻断，结果显示，SR BI抗体对低密度病毒感染的阻断作用强于对高密度病毒的阻断作用，而CD81抗体对不同密度病毒的阻断作用相似。用高密度、低密度病毒颗粒分别感染用SR BI shRNA慢病毒感染的Huh7.5.1细胞，也观察到类似结果。进一步我们分别观察SR BI、CD81抗体对删除了整个HVR1或HVR1中和表位的HCVcc的阻断作用，结果显示，SR BI抗体对两种突变HCVcc均无阻断作用，而CD81多抗对这两种突变HCVcc以及野生型HCVcc的阻断作用相似。这提示不同密度的病毒颗粒对受体的利用率有所差异，低密度病毒颗粒倾向于通过表面暴露的HVR1与SR BI受体的作用启动细胞侵入，而高密度病毒颗粒则可通过包膜蛋白与CD81受体的直接作用启动侵入。以上结果提示SR BI为HCVcc入侵宿主细胞的一个可备选的受体，HCV利用HVR1中的中和表位增强其与低密度脂蛋白的作用，从而增强其与SR BI受体的作用，避免与CD81受体的即刻作用，这对于HCV的免疫逃逸具有重要意义。小结1.我们先前以一例1a型HCV原型株患者在急性期以及慢性期多个时间点的HCV基因克隆和测序的结果为材料鉴定出HVR1中存在三个不同的微功能区。历经13年以后，该感染者HCV HVR1中的9个氨基酸发生突变，其中两个氨基酸突变位于感染调节区，一个氨基酸突变位于感染决定区，6个氨基酸突变位于中和表位中。我们检测这些突变对HCVpp感染性以及HVR1抗体中和活性的影响，结果显示，感染调节区和感染决定区中三个氨基酸的突变（aa1214）导致实验条件下HCVpp的感染性降低30%，但不影响H77HVR1抗体的中和活性；中和表位中6个氨基酸的突变（aa1619、aa22、aa24））导致HCVpp感染性升高40%，并且消除H77HVR1抗体的中和作用；突变全部9个氨基酸导致HCVpp感染性降低10%以及H77HVR1抗体中和活性的消失。这些结果提示HVR1的进化是不同位点随机突变与HVR1整体功能进化（即保持HCV感染性的同时实现免疫逃逸）的协调统一。2.观察不同密度HCV病毒颗粒对受体利用的差异性，结果显示，低密度HCVcc颗粒主要利用暴露于病毒表面的HVR1与靶细胞SR BI受体作用启动入侵，而高密度HCVcc颗粒则可通过暴露于病毒表面的包膜蛋E2直接与CD81结合；删除HVR1的HCVcc颗粒侵入肝细胞不再依赖于SR BI，但对CD81的依赖没有改变；HCV HVR1通过中和表位与脂蛋白作用，不仅增强了HCV的感染性，而且避免病毒与CD81受体的like作用，从而保护HCV抵抗E2抗体的中和。本研究在我们先前研究的基础上进一步揭示了HCV HVR1中和表位在HCV细胞侵入和免疫逃逸中的重要作用，推进了对HCV持续性感染机制的认识，并为HCV感染防治药物与疫苗的研发提供了新的思路。