根据2020年全球最新癌症统计数据显示,乳腺癌已超过肺癌成为全球最常见癌症,同时成为全球第五大癌症死亡原因,对世界各国经济和社会发展造成沉重负担。乳腺癌作为一种生发于乳腺导管内皮的恶性肿瘤,早期病变往往局限于乳腺导管内并沿乳管生长,此时可通过外科手术达到治愈的效果。然而肿瘤一旦突破导管基底膜发生浸润,则有部分肿瘤细胞进入全身血液循环进展为全身性疾病,此时即便经过规范的外科手术和全身辅助治疗,仍有相当一部分患者死于远处复发转移。因此早发现、早诊断、早治疗可显著改善乳腺癌患者预后。乳头溢液是乳腺癌患者除乳房肿块以外最常见的就诊主诉,伴有乳头溢液的乳腺癌患者最终病理结果以导管内癌为主。因此提高伴有乳头溢液的乳腺癌患者的诊治水平有利于提高乳腺癌患者的远期生存率。目前针对乳头溢液疾病的检出主要依赖细胞学检查,乳管造影,乳管镜检查等,这些检查手段分别具有各自的优点和应用局限性。乳头溢液细胞学涂片作为一种定性检查,查见癌细胞意味着明确的手术指征,但总体阳性检出率仅为百分之十左右;乳管造影中特征性图像可用于诊断及手术指征的把握,但无法仅根据图像做良恶性的鉴别诊断;乳管镜作为一种侵入性手段,仅能观察主乳管及分支乳管内的情况,对于生发于终末导管小叶单元的导管内病变无法观察且无法定性。因此开发一种乳头溢液中高灵敏、快速的早期乳腺癌诊断方法是当务之急。肿瘤标志物因其获取无创、方便,患者依从性强,在肿瘤普查、诊断、评价治疗效果、判断疾病发展及预后及随访观察等方面都具有较大的实用价值。目前临床上肿瘤标志物的应用越来越普遍,在临床上得到广泛认可的如:甲胎蛋白是肝癌的肿瘤标志物;CYFRA21-1是非小细胞肺癌的标志物;神经元特异性烯醇化酶（NSE）和胃泌素释放肽前体（ProGRP）是小细胞肺癌的标志物;鳞癌抗原（SCC）是鳞状上皮细胞癌的标志物等。目前乳腺肿瘤相关的血清学肿瘤标志物有CEA、CA153等,但因其敏感性、特异性不高,在乳腺癌早期诊断中价值有限,常用于提示预后、监测复发、评价治疗效果等方面。临床上更是缺少用于鉴别诊断良恶性乳头溢液的肿瘤标志物,因此迫切需要寻找具有应用潜力的肿瘤标志物用于乳头溢液中乳腺癌的筛查。人源热休克蛋白90alpha（Heat shock protein 90α,Hsp90α）是一种由732个氨基酸组成的蛋白质分子,是细胞中含量最丰富的蛋白质之一。在正常细胞内,Hsp90α作为分子伴侣蛋白,能够辅助蛋白质折叠和维持细胞内多种信号传导蛋白的稳定,从而促进细胞存活和生长。在肿瘤细胞中,Hsp90α能够帮助过度激活或突变的信号传导蛋白保持活性,从而促进了恶性肿瘤的发生、发展。Hsp90α能够被肿瘤细胞分泌到细胞外,在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。目前多项研究证实,Hsp90α在多种肿瘤患者的组织和血浆中水平上调,其含量与肿瘤的发生、进展、恶性程度尤其是转移密切相关,可以作为一个潜在的肿瘤标志物。Hsp90α在乳腺癌中的研究相对集中在细胞系及组织中,在血浆中的研究较少,且结论不统一,仍存有争议。有研究报道乳腺癌患者血浆中Hsp90α水平显著增高,但也有国外学者研究结果提示乳腺良恶性病变患者血浆中Hsp90α水平并不具有显著差异。进一步检索文献未见Hsp90α在乳头溢液中的相关研究报道。Hsp90α在乳头溢液中是否存在及其浓度水平、诊断价值尚不清楚。这将是我们本次课题研究的主要创新点和重点。同时,乳头溢液中Hsp90α水平与配对肿瘤组织中Hsp90α的表达相关性研究也未见报道。本研究拟分别检测乳头溢液及血浆中Hsp90α水平,以及其在乳头溢液相关肿瘤组织中的表达情况,并探讨其与临床病理参数之间的关系。同时我们利用蛋白质组学技术分析了 15例恶性乳头溢液和20例良性乳头溢液中的差异蛋白,进一步验证良恶性乳头溢液中Hsp90α含量存在差异。第一部分:乳头溢液中Hsp90α的水平检测及蛋白质组学验证与临床价值分析一、乳头溢液中Hsp90α的水平检测与临床价值分析研究方法:本研究纳入自2019年1月至2021年3月在山东大学齐鲁医院乳腺外科住院手术的伴有乳头溢液的患者110例,其中18例患者伴有双侧溢液,共获得128例乳头溢液样本。所有患者均行外科手术治疗并签署伦理知情同意书。收集乳头溢液标本及临床病理资料。128例样本包括乳腺癌32例（其中包括浸润性导管癌15例,导管内癌15例和小叶原位癌2例）以及良性乳腺疾病96例（其中包括导管内乳头状瘤72例,导管扩张11例,纤维腺瘤7例和乳腺增生6例）。所有标本使用酶联免疫吸附法（ELISA）进行Hsp90α检测,使用三明治式电化学免疫发光分析法（ECLIA）进行CEA、CA153检测。同时,回顾性获取病例资料中的所有血浆Hsp90α血清CEA、CA153数据。对良性乳腺疾病组和乳腺癌组进行数据统计,分析Hsp90α、CEA、CA153在乳头溢液中的诊断效力。研究结果:1.相比于良性溢液,恶性溢液中Hsp90α水平显著升高（P＜0.0001）。恶性溢液中CEA水平显著升高（P=0.0005）,而良恶性溢液中CA153水平无明显差异（P=0.1928）。2.ROC曲线分析显示Hsp90α、CEA用以区分良恶性乳头溢液的曲线下面积分别是0.8268、0.7086。Hsp90α的最佳诊断临界值为281.7 ng/ml,此时其敏感性为84.38%,特异性为84.38%。CEA的最佳诊断临界值为494.5 ng/ml,其敏感性为51.61%,特异性为90.22%。可见,乳头溢液中Hsp90α诊断价值优于CEA。两者联合诊断乳腺癌的ROC曲线下面积为0.857,诊断价值优于Hsp90α及CEA。3.从良性病变到乳腺原位癌,再到浸润性导管癌,乳头溢液中Hsp90α水平呈递增趋势,具有统计学差异（P＜0.0001）。4.乳头溢液中Hsp90α水平与Ki67表达呈正相关（r=0.3639,P=0.0480）。5.乳头溢液中Hsp90α水平倾向于在ER或PR阴性的乳腺癌患者中有升高趋势,但均不具有统计学意义（P值分别为P=0.0556,P=0.0584）。而Hsp90α水平与患者年龄、体重指数、肿瘤直径、病理分期、分子分型、淋巴结转移、HER-2表达、T分期、N分期均无明显相关性（P值均＞0.05）。6.乳头溢液中Hsp90α水平明显高于血浆中Hsp90α水平（P=0.0003）。二、蛋白质组学技术验证Hsp90α在良恶性乳头溢液中的表达差异研究方法:共收集2019年1月至2021年3月在山东大学齐鲁医院乳腺外科住院手术患者的乳头溢液样本35例,其中乳腺癌15例,导管内乳头状瘤20例,标本收集后第一时间投入液氮罐中保存。所有患者均签署伦理知情同意书,标本委托上海百趣公司进行蛋白质组学分析,寻找良恶性乳头溢液中差异表达蛋白。研究结果:共筛选得出859个差异蛋白,其中包括Hsp90α,乳腺癌组乳头溢液中Hsp90α水平较导管内乳头状瘤组上调13.74倍,P值＜0.01。结论:乳腺癌患者的乳头溢液Hsp90α水平升高,且从良性病变到乳腺原位癌,再到浸润性导管癌,Hsp90α水平呈递增趋势。乳头溢液中Hsp90α联合CEA检测可以作为乳腺癌潜在的诊断标记物。第二部分:乳腺癌患者血浆中Hsp90α水平检测及临床价值分析研究方法:回顾性收集自2019年1月至2021年3月于山东大学齐鲁医院乳腺外科手术的273例患者病例资料。所有入组患者均有明确的病理诊断,术前均常规检测血浆Hsp90α水平。良性91例（导管内乳头状瘤46例,纤维腺瘤31例,导管扩张8例,腺病4例,乳腺增生1例,腺肌上皮瘤1例）,恶性182例（导管内癌29例,浸润性导管癌136例,浸润性小叶癌6例,粘液腺癌6例,浸润性大汗腺癌2例,小叶原位癌1例,隐匿性癌1例,腺样囊性癌1例）。收集患者血浆Hsp90α及血清CEA、CA153数据,以及患者的临床病理参数如年龄、体重指数、肿瘤直径、淋巴结转移等,对良性乳腺疾病组及乳腺癌组样本之间进行数据统计,分析Hsp90α在血液中诊断效力,并与CEA、CA153进行比较,同时分析Hsp90α与患者临床病理参数的关系。研究结果:1.相比于良性乳腺疾病,乳腺癌血液中Hsp90α水平不具有显著差异（P=0.1057）。而乳腺癌血液中CEA、CA153水平显著升高,具有统计学差异（P＜0.05）。2.0到Ⅲ期乳腺癌患者血液中Hsp90α水平有升高趋势,但不具有统计学差异（P＞0.05）,但Ⅳ期患者血液中Hsp90α水平显著升高（尤其与0、Ⅰ、Ⅱ期相比,P值均＜0.05）。3.PR阴性乳腺癌患者较PR 阳性乳腺癌患者血液中Hsp90α水平显著升高（P＜0.05）。4.血液中Hsp90α水平与患者年龄、体重指数、病理分期、分子分型、肿瘤直径、淋巴结转移、ER表达、ki67表达、HER-2表达等临床病理参数之间均无明显相关性（P值均＞0.05）。结论:乳腺癌组及良性乳腺疾病组的血浆中Hsp90α水平不具有统计学差异,但在乳腺癌发生远处转移时可显著升高。血液中Hsp90α不适合作为肿瘤标志物应用于乳腺癌鉴别诊断,但具有提示远处转移的潜在价值。第三部分Hsp90α在乳腺癌组织中表达及临床意义分析研究方法:自山东大学齐鲁医院病理科所存剩余蜡块中切取第一部分研究病例中乳腺癌及导管内乳头状瘤患者组织标本（由于部分标本病变较小,行完常规病理检查后,已无法切取病变组织）,共收集到乳腺癌标本29例（浸润性导管癌14例,导管内癌13例,小叶原位癌2例）,导管内乳头状瘤标本33例。利用免疫组织化学染色法检测乳腺癌及导管内乳头状瘤组织中Hsp90α的表达;并根据免疫组化结果分析Hsp90α在二者组织中表达差异,并探讨其与乳头溢液中Hsp90α水平及临床病理参数的关系。研究结果:1.Hsp90α在乳腺癌及导管内乳头状瘤组织中表达无显著差异（P=0.0649）。2.Hsp90α在乳腺癌组织中的表达与其在乳头溢液中的表达无明显相关性（r=0.1605,P=0.2167）。3.Hsp90α在乳头溢液相关乳腺癌组织中的表达与肿瘤直径、淋巴结转移、ER表达、PR表达,Ki67、HER-2表达、分子分型、病理分期均无明显相关性（P值均＞0.05）。结论:Hsp90α在乳腺癌及导管内乳头状瘤组织中表达无显著差异,与其在乳头溢液中的浓度水平无明显相关性。Hsp90α在乳头溢液中的水平可能并不直接反映其在组织内的表达。