棉花黄萎病是一种严重的棉花病害，它能导致棉花叶片脱落，结铃率降低，从而影响棉花产量。其致病菌大丽轮枝菌（verticilliumdahliae）具有存活时间久，传播途径多等特点，防控非常困难。现在对棉花黄萎病的防治方法，主要有农业和药剂防治、抗病品种选育、生物防控等，但是这些方法都只能在一定程度上抑制黄萎病菌，不能根治黄萎病。由于至今还没找到有效的防治方法，黄萎病被称为棉花的“癌症”，每年给我国棉花的生产造成巨大的经济损失。因此，找到棉花黄萎病的致病基因将对黄萎病的防治起到重要作用。　　 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是近几年迅速发展起来的一种基因阻断技术，它是指内源性或外源性双链RNA导致细胞内靶标mRNA发生降解，进而阻断靶标基因表达的过程，它属于转录后水平的基因沉默。RNAi已成为一种强大的“基因沉默”技术，对于验证未知基因功能、调控基因表达、保护生物体免受病毒侵害等方面具有重要意义。具有发夹RNA结构（hairpinRNA，hpRNA）的双链RNA具有很高的特异性和高效性，被广泛应用于基因功能研究。　　 本论文中，构建了大丽轮枝菌nep基因的沉默表达载体，并进行了烟草遗传转化，从而为研究nep基因的功能奠定基础。　　 1.目标片段的扩增　　 为了构建沉默表达载体，利用PCR反应扩增了拟南芥苹果酸合酶基因的内含子3(ms-i3)，nep基因的正、反向片段。在扩增内含子时，首先提取了拟南芥的总DNA，然后以其为模板扩增出ms-i3。扩增nep基因的正、反向片段时，提取了大丽轮枝菌的总RNA，然后利用反转录试剂盒进行了反转录反应，得到大丽轮枝菌的cDNA，以cDNA为模板进行两轮巢式PCR反应，扩增出含有3端部分非翻译序列(UTR)的nep基因，接着以它为模板扩增出来正、反向片段。　　 2.沉默表达载体的构建　　 利用融合PCR的方法，将内含子，正、反向片段融合到一起，融合后的结构能转录出含有内含子的发夹RNA结构(ihpRNA)。利用PstⅠ和BamHⅠ限制性内切酶，对ihpRNA结构与植物表达载体pCAMBIA1305.1进行酶切。将酶切后的产物连接，成功构建沉默表达载体pCAMBIA1305+ihpRNA。利用电转化的方法，将沉默表达载体电转进农杆菌中，经过遗传标记筛选和PCR鉴定，获得了含有沉默表达载体的农杆菌。　　 3.烟草遗传转化　　 在进行烟草遗传转化过程中，以农杆菌介导的烟草叶盘转化系统为技术平台，以烟草的叶盘为外植体，用含有沉默表达载体的农杆菌LBA4404和EHA105对烟草进行转化。通过对烟草叶盘进行预培养、共培养、生芽培养和生根培养，获得了烟草再生苗。对它们进行GUS染色和PCR验证，发现再生苗转化成功。