青梅致腐霉菌的分离纯化及臭氧抑菌机理研究

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青梅营养物质丰富、含水量高、果皮薄,在采摘、运输、贮藏、鲜销、加工过程中由于机械损伤、病虫害等,易受真菌类病原微生物的污染造成腐烂变质,会大大地缩短果实的贮藏期,影响其市场占有率,相关的精深加工产业发展也会被限制,不能有效提升其附加值,严重制约青梅产业的升级。基于此,本课题通过分离纯化青梅采后致腐的真菌,研究臭氧对主要致腐真菌的抑菌机理,通过臭氧保鲜和气调包装创新青梅保鲜方法,为青梅加工及贮藏研究提供实验依据。(1)对采后青梅贮藏过程中霉腐部位的真菌进行分离纯化,经致病性验证后共得到3株霉菌;通过菌落形态特征、菌丝显微结构的观察结合分子生物学鉴定,分别为:日本曲霉(Aspergillus japonicus)、皮落青霉(Penicillium crustosum)及米曲霉(Aspergillus oryzae)。生物学特性研究表明:日本曲霉较其他2种霉菌具有广福的适应性;结合日本曲霉的分离率为83.3%和致病率为90%以上,确定日本曲霉为青梅采后贮藏过程中的主要致腐霉菌。(2)在离体条件下,探究不同条件的臭氧处理对3种霉菌的抑制效果。结果表明:臭氧处理可以显著抑制3种霉菌孢子萌发率和菌丝生长速度(p<0.05),使霉菌孢子悬浮液电导率和蛋白质溶出率升高(p<0.05);通过扫描电镜(SEM)观察到对照组与处理组之间明显的差别,臭氧处理造成霉菌细胞粗糙的表面和扭曲的菌丝并影响孢子形态及大小;综合3种霉菌实验结果来看,最佳离体抑制效果处理条件为:臭氧处理浓度为1518 ppm、处理时间为7590 min。(3)在活体条件下,对接种了日本曲霉的青梅果实采用不同条件的臭氧处理。结果表明实验组的果实发病率、病斑直径、丙二醛(MDA)含量积累均低于对照组;同时臭氧诱导了果实内多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性的增大(p<0.05),抑制可溶性固形物(TSS)含量的下降(p<0.05),延缓果实色泽劣变(p<0.05)。综合7个检测指标的实验结果,浓度为912 ppm,时间为6090 min的臭氧处理能提高青梅果实对致病菌的抗性,抑制日本曲霉的繁殖,延缓发病时间,减少发病率。(4)利用BGISEQ-500测序平台,对臭氧处理组和对照组的日本曲霉进行转录组测序分析。对差异表达基因进行筛选,通过FPKM值法筛选得到差异表达基因共499个,其中上调基因数目433个,下调基因数目66个。通过GO富集分析发现,差异基因富集到分子功能本体上的条目最多,在前20条显著富集到的差异GO Term中,富集到细胞成分相关的有膜的固有成分、组成成分和膜;富集到生物过程相关的有跨膜转运、运输、定位建立;富集到分子功能相关本体的有催化活性包括氧化还原酶活性、谷氨酸脱羧酶活性。通过KEGG富集分析发现显著富集的Pathway有代谢通路中的氨基酸代谢过程,主要包括牛磺酸和亚牛磺酸代谢、赖氨酸降解等;吲哚二萜生物碱的生物合成、类固醇生物合成;涉及碳水化合物代谢通路的有淀粉、蔗糖代谢、其他聚糖降解、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互转化;脂质代谢中的α-亚麻酸代谢过程。(5)将青梅经过不同浓度(0、9、15 ppm;60 min)和不同时间(0、45、75 min;9ppm)臭氧处理后,采用保鲜盒包装和气调包装(MAP;5%O2,10%CO2和85%N2)2种包装方式,以不做处理的作为对照组,共10个组;将10组青梅在保鲜库(4±1℃)中贮藏25 d。结果表明:臭氧单独处理和臭氧+MAP处理诱导了过氧化物酶(POD)的活性增大,而抑制了多酚氧化酶(PPO)的活性,且臭氧+MAP处理明显优于臭氧单独处理;对照组MDA含量均高于处理组;当臭氧和MAP结合处理时,能显著抑制失重、硬度的降低、色差变化(p<0.05),增强POD的活性和抑制PPO的活性,这表明臭氧和MAP具有协同作用。
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