目的:骨性关节炎(osteoarthritis,OA)是导致中老年人慢性残障的最常见原因,严重降低患者的生活质量,消耗大量的家庭和社会资源,由于膝关节承载负重性和人类的自然活动中膝关节使用的高频性,其膝关节骨性关节炎发生的频率要远远高于其他人体关节。基于OA现状,未有明显的特效药物治疗;晚期骨关节炎患者接受人工关节置换手术不但极大增加治疗费用,同时也存在巨大隐患(术后感染,假体老化等)。这一切都给骨关节炎治疗带来极大困难与阻力。然而,OA的病因至今仍然不明,可以肯定的是其病因由多种因素综合作用的复杂病理过程。研究表明骨关节炎的典型病理特征是关节软骨的退行性改变。软骨细胞作为关节软骨中唯一的细胞成分,起到支持和维持软骨正常形态和软骨微环境代谢平衡的作用。软骨细胞的病理改变是关骨关节炎最重要的病理特征,软骨细胞凋亡的异常激活、自噬失调节是骨关节炎时软骨细胞的基本病理特征。新型钙离子通道Transient Receptor Potential Cation Channels,Vanilloid subfamily member 5(TRPV5)是一种细胞膜蛋白,能够介导细胞外的钙离子(calcium aion,Ca2+)内流。对于维持细胞内钙离子平衡起着至关重要的作用。预实验发现TRPV5广泛存在于软骨细胞中,钙离子作为生命重要的无机物,不仅参与维持细胞内外渗透压的稳定。同时Ca2+作为第二信使参与细胞的增殖、分化、凋亡、自噬等重要的生命环节。并且大量证据表明在骨关节炎的软骨细胞中游离的钙离子明显增多。于是就此推测:TRPV5发生异常高表达介导细胞外钙离子内流诱导软骨细胞凋亡抑制软骨细胞自噬。运动与骨关节炎的关系一直是争论的焦点。大量证据都表明不同运动负荷可以通过不同程度的改变软骨细胞凋亡和自噬,进而改变骨关节炎的进程。于是就此推测:不同的运动负荷通过改变骨关节炎软骨细胞中TRPV5的表达量,影响骨关节炎疾病的进程。综合前面证据与假说,本研究分四部分内容进行探讨。第一部分:探讨TRPV5在大鼠骨性关节炎软骨细胞中表达水平的变化;第二部分:探讨TRPV5通过介导细胞外钙离子内流抑制软骨细胞自噬的机制;第三部分:探讨TRPV5通过介导细胞外钙离子内流诱导软骨细胞凋亡的机制;第四部分:探讨在不同运动负荷下骨关节炎大鼠软骨细胞中TRPV5表达水平的变化。从一个全新视角阐述骨关节炎的发病机制以及运动对骨关节炎的影响。研究方法:1.SD大鼠膝关节骨性关节炎模型的构建:选取75只2月龄体重在220g-230g健康雄性SD大鼠随机分5组,实验组3组膝关节无菌注入5mg/ml碘乙酸50μl,第4组注入碘乙酸+TRPV5抑制剂ruthenium red;对照组注入正常生理盐水50μl。2.对各组大鼠膝关节骨关节炎的评价:(1)各组大鼠膝关节X-ray拍摄及影像学评分;(2)各组大鼠膝关节大体观察评价;(3)各组大鼠膝关节组织切片后HE和甲苯胺蓝染色;(4)各组大鼠膝关节Mankin评分。3.各组大鼠膝关节软骨组织中TRPV5表达量的检测:(1)采用real-time RCR检测各组软骨组织中TRPV5 m RNA表达水平;(2)采用western-blotting方法检测各组软骨组织中TRPV5蛋白表达水平。4.检测各组中大鼠膝关节软骨组织自噬水平(1)各组膝关节组织切片后免疫组化检测LC3B在膝关节软骨组织中的定位及表达情况;(2)Western-blotting方法检测各组软骨组织中LC3Ⅱ蛋白表达水平。5.分离大鼠膝关节软骨细胞,体外模拟骨关节炎刺激软骨细胞后检测自噬水平(1)提取大鼠膝关节软骨细胞,免疫组化鉴定表型,稳定培养传代后待用;(2)采用si RNA干扰敲减TRPV5,Real-time RCR和western-blotting检测敲减效率;(3)免疫荧光软骨细胞中检测LC3B和钙结合蛋白calmodulin表达水平。6.各组软骨细胞内钙离子浓度测定通过fluo-3AM细胞内钙离子染色,以背景基础底色F0,随机抽取待测视野的所有细胞平均荧光强度为F,最后计算比较的荧光强度为F/F0。7.TRPV5诱导软骨细胞自噬抑制通路中的蛋白分子检测(1)Western-blotting检测软骨细胞中TRPV5、calmodulin、CAMKⅡ、p-CAMKⅡ、Beclin1、P-Beclin1、LC3Ⅱ和Bcl-2的蛋白表达水平检测;(2)免疫共沉淀法检测Beclin1和Bcl-2的结合作用。8.检测各组中大鼠膝关节软骨组织凋亡及calmodulin表达水平(1)免疫组化检测calmodulin在膝关节软骨组织中的定位及表达情况;(2)采用western-blotting方法检测各组软骨组织中calmodulin和cleaved caspase-8蛋白表达水平。9.不同刺激组中软骨细胞凋亡率的检测通过Annexin V-FITC&PI对细胞染色后,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡情况。10.TRPV5诱导软骨细胞凋亡通路中的蛋白分子检测Western-blotting检测软骨细胞中TRPV5、calmodulin、DAP、FADD、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-6、cleaved caspase-7的蛋白表达水平。11.骨性关节炎大鼠运动负荷模型的构建(1)注射碘乙酸诱导骨性关节;(2)不同运动负荷跑台训练(分为低,中,高等强度训练;每个运动强度又分为10天,20天,40亚周期)。12.对各组骨性关节炎大鼠运动负荷后膝关节骨性关节炎的评价(1)各组大鼠膝关节影像学评分;(2)各组大鼠膝关节组织切片番红-固绿染色。13.各组骨性关节炎大鼠运动负荷后膝关节软骨中TRPV5表达量的检测Western-blotting检测软骨组织中TRPV5蛋白表达的水平。结果:1.各组膝关节骨性关节炎的评价(1)X-ray显示:对照组关节间隙正常,软骨表面光滑圆润,无骨赘形成。然而注射碘乙酸诱导大鼠膝关节骨性关节炎出现关节间隙变窄,软骨表面不光滑,有骨赘形成,注射时间越长,骨关节退行性病变越重。21天联合注射ruthenium red(TRPV5抑制剂)组显示:相对于单纯注射碘乙酸21天大鼠关节间隙变窄缓解,软骨表面光滑尚可,骨赘形成有所减少。X-ray系统评分结果与之一致;(2)大鼠膝关节大体进行评估评分发现:正常对照组的大鼠膝关节显示:软骨光滑,色泽鲜艳无软骨破坏。注射碘乙酸组的大鼠膝关节显示:软骨灰暗,出现软骨破坏,注射时间越长病变越明显。然而注射ruthenium red的大鼠膝关节组中软骨破坏有所减轻;(3)关节软骨经HE和甲苯胺蓝染色后发现:正常组软骨未退变。在碘乙酸注射后软骨表面不平见裂隙,甲苯胺蓝染色失染,随着注射时间延长,染色失染更加明显。然而注射ruthenium red组显示:软骨细胞排列相对整齐,软骨层相对较厚,未出现明显裂隙,未见明显染色失染。骨关节病的严重程度由Mankin评分来表示。2.不同组膝关节软骨组织中TRPV5表达水平的检测(1)Real-time PCR检测软骨组织中TRPV5 m RNA表达情况:与正常大鼠关节软骨相比,随着疾病的进程(MIA注射时间的延长),TRPV5 m RNA的表达量逐渐升高。在21天组达到最大,并且加入TRPV5抑制剂ruthenium red并未明显降低TRPV5m RNA的表达量;(2)TRPV5蛋白表达趋势与TRPV5 m RNA表达相一致。3.大鼠膝关节软骨组织中自噬水平的变化(1)LC3B免疫组织化学染色发现:在对照组,LC3B弱表达。在碘乙酸注射制造骨关节炎模型7天组LC3B有增强的趋势,在14天LC3B棕色阳性结果明显减弱,在21天组LC3B显著减弱,然而注射TRPV5抑制剂后,表达量有所增强;(2)Calmodulin、LC3Ⅱ蛋白定量发现:经过MIA刺激后,关节软骨中LC3Ⅱ的表达量有所下降,并且随着疾病的进程表达量逐渐降低,然而加入TRPV5抑制剂ruthenium red后,LC3Ⅱ的表达量却有所升高。LC3-II/LC3-I的比值与LC3-II表达趋势相一致。同时发现:calmodulin的表达量与LC3-II蛋白表达量呈现相反趋势。4.体外培养的大鼠膝关节软骨原代细胞经MIA诱导后自噬水平的变化(1)TRPV5-si RNA慢病毒感染大鼠原代关节软骨细胞:干扰组TRPV5表达量明显降低,干扰效率约75%;(2)稳定传代的软骨细胞,经不同浓度刺激后免疫荧光显示:随着MIA浓度增加,LC3B的表达出现了先升高后下降的趋势,加入ruthenium red或者敲减TRPV5后发现,LC3B的表达再一次出现升高;然而calmodulin表达逐渐增强,加入TRPV5抑制剂或者敲减TRPV5后发现,calmodulin表达逐渐增强有所下降。5.检测各组TRPV5介导钙离子内流的离子通道的功能性发现:(1)随着加入MIA浓度的增加(0μM,1.5μM,3μM,6μM)钙离子染色的荧光强度逐渐加深,在6μMMIA中荧光强度达到最强,然而加入TRPV5抑制剂ruthenium red和si RNA干扰TRPV5后发现,荧光强度明显减弱;(2)在6μMMIA刺激后,加入钙离子螯合剂后,荧光强度也减弱;(3)细胞内钙离子浓度具有MIA浓度依赖和时间依赖性(随着诱导时间增加,钙离子浓度逐渐增加)6.TRPV5诱导软骨细胞自噬抑制通路中的蛋白分子表达水平的变化(1)我们提取经过MIA刺激后的软骨细胞的蛋白,我们发现了:TRPV5、calmodulin、p-CAMKⅡ、p-Beclin1和Bcl2随着加入MIA浓度的增加(0μM,1.5μM,3μM,6μM)表达量逐渐增加,而CAMKⅡ、Beclin1总蛋白量并没有明显变化。然而LC3Ⅱ蛋白量却随着加入MIA浓度的增加(0μM,1.5μM,3μM,6μM)表达量逐渐减少,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也随之明显下降;(2)我们还发现:在6μM MIA刺激的同时给予TRPV5抑制剂或是敲减TRPV5刺激后,calmodulin、p-CAMKⅡ、p-Beclin1和Bcl2却明显减少,LC3Ⅱ蛋白量表达量却显著增加,同时6μM MIA刺激后,增多的Bcl-2可以与Beclin1结合。7.经过MIA诱导的大鼠膝关节软骨细胞凋亡水平的变化(1)大鼠骨关节病软骨中cleaved caspase-8蛋白表达水平发现:经过MIA刺激后,关节软骨中cleaved caspase-8的表达量并且随着疾病的进程逐渐升高,然而加入TRPV5抑制剂ruthenium red后,cleaved caspase-8表达量有所下降。(2)免疫荧光显示:随着MIA浓度增加,cleaved caspase-8表达逐渐增强,然而加入TRPV5抑制剂ruthenium red或者敲减TRPV5后发现,calmodulin表达逐渐增强有所下降。(3)凋亡试剂盒检测软骨细胞凋亡率现随着MIA浓度的增加,软骨细胞凋亡的率从3.19%逐渐增加到18%,然而加入TRPV5抑制剂或是敲减TRPV5后,即使在最大浓度的MIA刺激时,软骨细胞的凋亡率也下降。8.TRPV5诱导软骨细胞凋亡通路中的蛋白分子表达水平的变化我们提取经过MIA刺激后的软骨细胞的蛋白,我们发现了:TRPV5、calmodulin、DAP、FADD、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3、cleaved caspase-6、cleaved caspase-7随着加入MIA浓度的增加(0μM,1.5μM,3μM,6μM),这些蛋白的表达量逐渐增加,而caspase-8、caspase-3、caspase-6、caspase-7总蛋白量并没有明显变化。在敲减TRPV5或加入TRPV5抑制剂亦或是加入钙离子螯合剂这些由于MIA刺激后上调的蛋白均下调。9.各组骨关节炎大鼠运动负荷后膝关节骨关节炎的评价:(1)运动负荷膝关节X-ray进行评估评分发现:不同的运动负荷,大鼠膝关节X-ray表现出现显著差异。相比于骨关节炎不运动的对照组,其中高等强度运动负荷中,关节间隙变窄和骨赘形成明显,并且运动的时间越长;骨赘形成的越明显。中等强度运动负荷中,骨赘形成较高等运动强度相对较轻;低等运动强度运动负荷相比于对照组,关节间隙有所恢复,骨赘形成较少。(2)不同的运动负荷,大鼠膝关节关节软骨破坏显示出显著差异。相比于对照组的单纯骨关节炎,其中在高等和中等强度运动负荷中,软骨破坏明显,软骨表面变得更加不平整,并且运动时间越长,破坏的越明显。然而在低等强度组,软骨相对较光滑圆润,色泽鲜艳无软骨破坏。(3)关节软骨经番红-固绿染色后观察:其中以高等和中等强度运动负荷中,失去正常的软骨层次结构,软骨细胞进一步的染色失染。10.各组骨性关节炎大鼠运动负荷后膝关节软骨中TRPV5表达水平的变化经过不同运动负荷训练后,关节软骨中TRPV5蛋白的表达量呈现明显差别:其中,与对照组相比,低等强度训练TRPV5蛋白的表达量呈现低表达状态,时间越长,表达量越低;而中等强度训练和高等强度训练,TRPV5呈现高表达状态,运动周期越长,表达量越高。结论:1.关节软骨细胞中存在TRPV5的表达,在骨关节炎发生时,TRPV5的表达量有所增加,并且增加程度和骨关节炎疾病的进程呈现正相关。2.关节腔注射TRPV5离子通道的抑制剂ruthenium red,可以明显延缓骨性关节炎疾病的进程,TRPV5作为离子通道的功能参与骨性关节炎疾病的发生。3.在骨关节炎发生时,TRPV5的表达量增加,高表达的TRPV5可以增加介导细胞外钙离子内流。4.内流增加的钙离子可以与calmodulin结合形成Ca2+/Ca M复合体,Ca2+/Ca M复合体磷酸化CAMKⅡ,p-CAMKⅡ磷酸化Beclin1,p-Beclin1抑制自噬小体形成,进而抑制软骨细胞自噬。钙离子增加Bcl-2和Beclin1结合形成复合物进一步协同发挥抑制软骨细胞自噬,导致骨关节炎的发生。5.在骨关节炎发生时,Ca2+/Ca M复合体级使caspase-8发生自剪切形成cleaved caspase-8,cleaved caspase-8能够剪切caspase-3、6、7诱导软骨细胞凋亡,导致骨关节炎的发生。6.不同的运动负荷对大鼠骨关节炎作用不同,其中低等强度对骨关节炎具有保护作用,运动时间越长,保护作用越明显;而中等强度和高等强度能够加重骨关节炎,并且运动时间越长,骨关节炎病变越重。7.不同的运动负荷的骨关节炎大鼠关节软骨细胞中TRPV5表达量不同,其中低等强度降低TRPV5表达量,而中等强度和高等强度能够增加TRPV5表达量。