表面活性剂是一类最重要的精细化工产品,广泛应用于家庭、工业和农业。人们生活工作的各个方面几乎都离不开表面活性剂。随着人类社会的进步与发展以及人们环保意识的增强,生物表而活性剂替代化学合成的表面活性剂将成为必然趋势。槐糖脂是一类由酵母产生的糖脂类生物表面活性剂,由于其具有高产量、生物可降解性、低毒性和良好的环境兼容性等许多优点,可广泛应用于石油、环境保护、化妆品、洗涤剂、药学及纳米科技等工业领域,尤其是在医药领域的应用得到了研究者的广泛关注。因此,槐糖脂被认为是一种最有发展和应用潜力的、可能替代化学表面活性剂的可再生的生物表面活性剂,对其开发及应用将会带来极大的经济效益和生态效益。本论文的主要研究内容及结果如下：1.低能离子束注入诱变选育高产槐糖脂菌株目前,对产槐糖脂菌株的诱变育种研究较少。本论文对实验室现有的产槐糖脂菌株W. domercqiae Y2A采用低能N+注入的方式进行了诱变育种。选取N+作为离子束注入的离子源,发现经过不同剂量N+注入后,菌株Y2A的存活率曲线是典型的“马鞍型”曲线,即随着注入剂量增加,存活率呈现出先降低后升高再降低的趋势。选取的诱变剂量是3×1015ions/cm2,经过注入诱变选育后,18个突变株菌的总槐糖脂产量较出发株提高了20%以上,18个突变株的内酯型槐糖脂产量较出发株提高了100%以上；5个突变株的酸型槐糖脂产量较出发株提高了30%以上。其中,菌株N3-18在摇瓶水平发酵时总槐糖脂产量可达104g/L,较出发株提高了约84.71%,酸型槐糖脂产量达77g/L,较出发株提高了1.48倍；在5-L发酵罐水平,其总槐糖脂产量可达135g/L,较出发株产量提高一倍左右。出发株和5株高产菌株所产的总槐糖脂组成的HPLC分析表明,各突变株所产槐糖脂组成同出发株相同,但是,突变株的多数槐糖脂分子的峰面积较原菌株有较大提高,某些槐糖脂组分在总槐糖脂中所占的比例同野生株有较大变化,得到了内酯型或者酸型槐糖脂比例增加的突变株,而这些特定的高产菌株可以更好的应用于不同的工业领域。2.新型槐糖脂的生产、分离纯化及结构鉴定槐糖脂的结构会影响其理化活性和生物学活性。天然合成的槐糖脂脂肪酸部分通常是16C或18C,本工作旨在获得脂肪酸部分碳链>18C或者为C18：3的新型槐糖脂。分别以菜籽油、亚麻油和鱼油为疏水性碳源发酵槐糖脂,得到了三种组分差异较大的槐糖脂混合物。利用制备型HPLC制备得到了这三种槐糖脂粗品中的主要组分,并用MS、MS/MS和GC-MS分析了这几种槐糖脂纯品的结构。以亚麻油为底物时,首次在W. domercqiae中得到了脂肪酸部分为C18：3的双乙酰化内酯型槐糖脂,并且,该物质的抗肿瘤活性未有报道。以富含长链脂肪酸的鱼油为底物时得到了碳链长度大于18C的新型槐糖脂,包括：脂肪酸部分为C20：5的,不含、含有一个或两个乙酰基的酸型槐糖脂；脂肪酸部分为C22：6的双乙酰化酸型槐糖脂：脂肪酸部分为C22：3的无乙酰基的内酯型槐糖脂：脂肪酸部分为C20：0的无乙酰基的内酯型槐糖脂。这些新型槐糖脂可能会拓宽槐糖脂的应用领域。3.槐糖脂脂肪酸部分结构对其抗宫颈癌活性影响、体外诱导细胞凋亡的途径和体内抗宫颈癌活性的研究虽然之前的研究已经证明了槐糖脂纯品的乙酰化程序、脂肪酸部分的不饱和度及是否存在分子内内酯化等都会影响其抗肿瘤活性,脂肪酸的碳链长度和多不饱和度(双键>2)对槐糖脂抗肿瘤活性的影响还没有被系统研究过。另外,槐糖脂引起细胞调亡的信号通路也不清楚。目前,槐糖脂的抗肿瘤活性多限于体外实验,体内抗肿瘤活性报道非常少。选取6种双乙酰化内酯型槐糖脂分子,其脂肪酸部分分别为C18：0,C18：1,C18：2,C18：3,C16：0和C16：1,对这些槐糖脂分子对HeLa和CaSki(?)胞的细胞毒性进行了研究。结果农明,槐糖脂的细胞毒性大小不仅受脂肪酸不饱和度影响,同时也受脂肪酸链长影响。研究脂肪酸链长对槐糖脂体外抗宫颈癌活性的影响发现：碳链长度越长,槐糖脂的细胞毒性越大。不同槐糖脂分子的细胞毒性应该是脂肪酸不饱和度、碳链长度和槐糖部分乙酰化共同作用的结果。对抗宫颈癌活性最好的脂肪酸部分为C18：1的双乙酰化内酯型槐糖脂组分的体外抗宫颈癌机制进行了深入研究,利用相差显微镜、电子显微镜及TUNEL等证明了该组分可以诱导HeLa细胞发生凋亡,流式细胞术检测细胞周期分布发现,该槐糖脂作用后出现了明显的二倍体亚峰,且多数细胞被阻滞在G0期,少部分细胞被阻滞在G2期。利用荧光定量PCR分析发现槐糖脂可以诱导HeLa细胞内质网应激的特异性蛋白CHOP和Bip蛋白的表达,而caspase-12和caspase-3也同样被激活,说明槐糖脂可以通过ER应激通路来诱导HeLa细胞发生细胞凋亡。而对线粒体膜电位变化及胞质中细胞色素C的含量检测发现,槐糖脂作用前后二者变化不大,说明线粒体通路可能没有参与槐糖脂诱导的细胞凋亡。建立了小鼠宫颈癌U14细胞的移植瘤模型,以研究槐糖脂的体内抗宫颈癌活性,发现内酯型槐糖脂粗品对人宫颈癌裸鼠移植瘤有较好的抑制作用,低、中、高剂量的槐糖脂给药组抑瘤率分别可以达到15.73%、26.40%和34.83%。并且,槐糖脂在体内也可以诱导肿瘤组织发生细胞凋亡。4.主要酯酶／脂肪酶和单加氧酶在槐糖脂合成中的功能的初步研究目前,还没有发现催化酸型槐糖脂分子形成内酯的内酯化酶。通常,催化合成内酯的酶类可能为硫酯酶或者酯酶／脂肪酶及特定的单加氧酶。本工作利用W.domercqiae基因组注释及该菌株在硫酸铵和酵母粉两种条件下基因表达水平的差异对可能完成催化内酯化反应的酯酶／脂肪酶及单加氧酶进行了筛选,研究其在槐糖脂合成中的作用。首先,建立了W.domercqiae的遗传操作系统：确定潮霉素为抗性筛选标记,甘油三磷酸脱氢酶的启动子Pgpd可作为外源基因表达的启动子,电转化的方法可以高效完成外源基因的导入。通过基因组及表达谱分析,选取了酵母粉条件下较硫酸铵条件下表达显著上调的8个酯酶／脂肪酶基因及4个单加氧酶,利用double-joint PCR的方法成功构建了基因的敲除盒,对这12个基因进行了成功敲除,并对其在槐糖脂合成过程中的功能进行了初步分析。lipB基因可以影响多种槐糖脂组分的合成,ΔlipB敲除株槐糖脂产量较野生株大幅下降,当以油酸为单一碳源时,ΔlipB敲除株无法检测到槐糖脂产生。通过胞外蛋白分析及荧光定量PCR检测槐糖脂合成过程中关键酶的表达情况,推测敲除株产量降低的原因包括两个方面：菌株内与槐糖脂合成相关的关键酶的表达量下调；胞外糖苷水解酶含量增加,可能通过水解槐糖脂的糖苷键而使槐糖脂产量下降。△moA(?)敲除株所产酸型槐糖脂C18:2DASL在总槐糖脂中比例增加而内酯型槐糖脂C18：2DLSL所占比例则有较大下降,推测(?)moA(?)基因的功能应该是同脂肪酸部分为C18：2的酸型槐糖脂的内酯化相关。noD基因影响了C18:2NASL的乙酰化。在以葡萄糖和豆油为底物时,同野生株相比,ΔlipD、ΔlipE、 ΔlipF和ΔlipG敲除株发酵所得槐糖脂产量均有所降低,槐糖脂中乙酰化程度较高的组分含量降低,而乙酰化程度相对较低的组分含量增加,推测这种现象的出现是由于脂肪酶/酯酶的缺失使菌株将油脂水解为脂肪酸的能力下降,从而间接影响槐糖脂的合成,同时,脂肪酶可能也有催化槐糖脂乙酰化的功能,它的缺失导致槐糖脂乙酰化程度降低；而当以葡萄糖和油酸为底物时,由于油酸为单一脂肪酸,这几个敲除株槐糖脂产量及组成无显著变化。lipH基因同脂肪酸部分为C18：2的酸型槐糖脂的内酯化有一定关系,并且对菌株将C18：1整合入槐糖脂的过程也有一定影响。除moA和lipH基因同脂肪酸部分为C18：2的酸型槐糖脂的内酯化相关外,其它几个基因的敲除多对槐糖脂内酯化无显著影响,推测菌体内的内酯化酶应有多种。5.鼠李糖基转移酶在拟威克酵母中的异源表达为获得具有更好的生物学活性或表面活性的槐糖脂分子,对槐糖脂的结构修饰通常是通过化学法或酶催化法进行,而本论文则成功构建了鼠李糖基转移酶A和B基因(rhlA和rhlB)在W. domercqiae中的表达载体,对W. domercqiae Y2A进行遗传改造,筛选得到了相应的重组菌株Y2A-2,使其具有表达鼠李糖基转移酶1的能力。利用HPLC-MS的方法对重组菌株发酵的糖脂结构进行鉴定,发现两个组分(保留时间分别为16.74和17.47)的分子量分别为554(C26H50O12)和536(C26H48O11),前者可能为含1分子葡萄糖、1分子鼠李糖,脂肪酸部分为C14：0的无乙酰基的酸型糖脂,后者可能是含有两个鼠杍糖的、脂肪酸部分为C14：1的糖脂,为我们所要获得的目的糖脂；利用制备型HPLC,分离得到了含有一个鼠李糖的、脂肪酸部分为C18：3的酸型糖脂和既含有葡萄糖也含有鼠李糖、脂肪酸部分为C14：1的酸型糖脂。此外,同野生株相比,重组菌株产酸型槐糖脂的能力提高,而产内酯型槐糖脂能力下降。