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亳菊(Dendranthema morifolium‘Bozhou’)主要产于安徽省亳州市,是安徽省道地中药材,也是我国四大名菊之一。其花中含有的生物活性物质,如挥发油、黄酮类化合物等成分能疏风清阳、明目解毒,主治高血压,冠心病等,且具有抗癌、抗肿瘤等功效,也是常用饮料的主要添加调味剂之一,是药用和饮料兼用的中药材,具有很高的经济价值。 一直被认为药用菊花中品质最好的亳菊由于种性退化严重、易感染、抗逆性弱等原因而面临极大的风险,真正的亳菊种植面积正在逐渐的减少。据统计,安徽省由于干旱导致的亳菊减产远多于其他非生物因素造成的减产的总和。因此,改良亳菊耐旱性水平是目前关键技术之一,但由于亳菊属高度杂合,常规的杂交等育种技术很难得到应用。 本试验根据转基因技术原理,以亳菊茎段外植体为受体材料,抗草甘膦除草剂为筛选标记基因,通过发根农杆菌介导法转入EDT1抗旱基因,取得以下结果: 1.通过热激转化法将工程载体质粒导入发根农杆菌A4中,对工程菌生长曲线测定结果表明,工程菌对数生长期在OD600=0.6左右。 2.以草甘膦为筛选剂,设置50 mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L,5个浓度梯度,对亳菊组培苗致死率的研究表明,其最佳筛选浓度为100mg/L。 3.通过农杆菌介导,对影响亳菊遗传转化效率的四个因素进行讨论:侵染时间、农杆菌菌液浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间,在菌液浓度(OD600)为0.6-0.8,乙酰丁香酮浓度150μmol/L,侵染时间25 min,共培养3d,除菌培养后,可得到15d最大转化效率95.6%。 4.剪取诱导产生的毛状根2 cm左右,转入愈伤组织诱导培养基中,诱导产生愈伤,两周继代培养一次,可以得到大量丛生芽。 5.剪取2 cm左右丛生芽转接入生根培养基中,并在生根培养基中添加100mg/L的草甘膦作为筛选剂,无菌培养30 d,采用CTAB法,提取在添加筛选剂下能正常生长的植物叶片基因组DNA,通过聚合酶链式反应(PCR)检测,初步得到5株转基因植株。 6.在干旱胁迫下,分别提取并测定亳菊叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的含量,结果表明,转基因植株相对于非转基因植株具有较高的耐旱性。