骨骼肌组织工程的医学介入,在改善移植细胞的质量和生存方面拥有巨大潜力。目前在骨骼肌三维培养、体外大块组织构建等方面面临巨大的挑战,使各种原因造成的失骨骼肌组织功能的重建缺乏功能性组织代用品而受阻。运用组织工程替代品体内修复缺失的肌肉功能是有困难的：1、再建肌肉组织需要具有天然组织结构和充分的再生能力；2、组织结构进入宿主后缺乏活力和相容性。许多学者在骨骼肌的体外构建和替代研究方面做了大量研究,试图创建功能化的肌组织：Dennis和Kosnik等探索出三维骨骼肌组织的自组装模式,将成肌细胞和成纤维细胞共培养,由成纤维细胞产生细胞外基质并包裹形成肌管,横向电刺激时产生持续的兴奋和收缩；德国的Bach研究组进行了成肌细胞与纤维蛋白三维支架的复合培养,获得具有极性分化功能的多核肌管；Sxena采用聚乙醇酸网与成肌细胞复合并进行体内移植,获得血管化的骨骼肌样组织。尽管国外学者已涉及骨骼肌组织工程三维构建研究,但都处于初级摸索阶段,国内目前尚没有体外骨骼肌三维构建的文献报道。鉴于国内外现状,我们实验组在体外三维骨骼肌的构建方面进行初步的探索。众所周知,骨骼肌组织工程包括三要素,即干细胞、支架、生长因子。细胞与支架材料的相互作用是组织工程研究的主要领域,其目的是使细胞能在基质材料上贴附和正常生长。体外条件下,能否获取极性、平行排列的分化肌管,是三维肌组织构建成功的关键,因为肌纤维的平行排列特性,是肌组织发挥收缩功能的形态学基础。我们实验组运用修饰后的硅酮弹性体作为三维支架与C2C12细胞共培养获取极性肌管。硅酮弹性体(Sylgard 184)有柔性基底层特征,表面光滑并具有一定的弹性,便于检测细胞移动和加载产生的牵拉力。前期的实验筛选了sylgard 184支架修饰包被的最佳基质材料,使成肌细胞与基质材料具良好相容性；并掌握细胞在材料表面的增殖、分化特性,初步探索了体外构建肌组织的可能性。在此基础上我们将进一步完善骨骼肌的体外三维构建,优化极性平行肌管培养方法,改善Sylgard 184铸槽技术。通过修饰后的铸槽对分化期C2C12细胞的极性诱导、促分化、促延展作用,获取高密度、极性分化、具备收缩蛋白和生肌转录因子表达能力的肌管,使其结构更接近在体生理状态,并检测分析Sylgard 184三维基质材料对成肌干细胞生长分化的影响。为更优化体外肌组织类似物的构建,我们尝试应用具良好生物相容性、降解特性、在组织工程研究领域获得广泛应用的生物支架材料PGA与C2C12进行复合培养,探讨体外相容性和构建的可行性。同时进行三维和传统平面培养两种不同的培养方法获取肌管,检测成肌转录因子和生肌标志蛋白表达,从成肌特性、收缩功能等方面进行分析,比较研究三维与平面培养细胞形态及功能差异,为下一步的三维肌组织构建和应力拉伸研究提供理论和技术支持。这种体外培养三维极性肌管成分比较单一,可以避免其他因素的干扰,是研究肌细胞和肌组织自身功能活性的良好模型,有助于我们了解细胞发育中的一些基本原理。所构建的肌组织模型进一步研究有望能够替代体外骨骼肌组织,加载相应处理因素,为各种肌病的病因研究模拟病理学条件。我们的主要研究内容第一章硅酮弹性体(sylgard 184)三维基质材料对成肌干细胞生长分化的影响[目的]铸型并修饰的Sylgard 184与C2C12细胞复合培养获取三维极性肌管并检测分析硅酮弹性体三维基质材料对成肌干细胞生长分化的影响。【方法】Sylgard 184双组分以10：1的比例均匀混合,倒入6孔板中,半固化时对Sylgard 184表面进行压痕铸型,每条铸槽长25mm,宽0.8mm,深lmm,置生物安全柜完全固化,Matrigel和胶原混合液均匀铺被凹槽底部,紫外线照射备用。接种密度为1×106／ml的C2C12细胞悬液,细胞融合80%时,加入含2%马血清的DMEM/F12分化培养以获取极性肌管。倒置显微镜、HE染色观察肌管的分化状态及结构,RT-PCR、免疫荧光检测。【结果】Sylgard 184凹槽表面生长的C2C12细胞诱导分化10d后,镜下可见融合为多核、极性生长的肌管；20d时可见肌管明显增粗、成熟、极性平行分布,相互融合形成肌组织类似物,有自主收缩性。HE染色可见平行的肌管内有大量细胞核存在,PCR检测到MyoD、Myogenin mRNA阳性表达；免疫荧光实验检测极性肌管内分化特异性标志蛋白Myogenin、成肌特异性蛋白F-actin、MHC表达密集,表明构建的肌组织类似物有成肌特征和收缩性。【结论】铸型的Sylgard 184凹槽具有一定的方向引导效应,复合培养C2C12细胞,能诱导分化形成多核、重叠、极性肌管。实验表明,经修饰的Sylgard 184三维支架为成肌干细胞提供赖以寄宿、增殖和分化的场所,具有良好的生物相容性,能增进细胞的黏附和增殖,引导多核肌管极性生长,促进肌样分化,诱导组织再生,所获得的骨骼肌组织类似物具有肌组织的生物学特性,其结构更接近在体生理状态。为下一步成功构建较大体积的体外三维肌组织模型奠定基础。第二章聚羟基乙酸(PGA)与成肌干细胞的体外相容性研究【目的】观察成肌干细胞在聚羟基乙酸(PGA)上的粘附生长情况及在体外形成肌组织类似物的能力。【方法】将松散的PGA纤维缠绕固定在盖玻片表面,确保纤维的平行排列和维持一定的张力。PGA纤维束长3cm,直径约0.2cm。碘酒、乙醇浸泡消毒,0.1%PBS冲洗,Ⅰ型胶原和Matrigel混合物包被,紫外线消毒30min。加入含10%FBS的DMEM/F12培养基,置37℃5%CO2孵箱预培养3d。接种C2C12细胞浓悬液,与PGA材料进行复合培养、分化,扫描电镜下观察C2C12细胞与PGA的粘附生长情况。【结果】PGA纤维束接种C2C12细胞后,倒置显微镜下可见细胞生长状态良好,均匀粘附于纤维表面及空隙中,细胞椭圆至梭形,沿PGA纤维纵轴方向向两极伸展,与材料相容良好,PGA纤维与贴壁生长的细胞之间无间隙和距离。分化培养7d后,对分化形成的肌组织类似物行扫描电镜,可见PGA纤维表面有较多的贴附生长的成肌细胞,肌管沿PGA平行排列方向生长,融合形成膜状结构,细胞基质分泌旺盛,肌管的分化不均一,长短、直径不一致,分化肌管存活良好。成肌干细胞与PGA纤维有较好的生物相容性。【结论】PGA是目前应用最为广泛的组织工程支架材料,其良好的生物相容性、降解特性和体内良好归宿,获得组织工程研究者的青睐。由于PGA纤维能够平行排列成束,有极性诱导效应,且细胞悬液易于渗透,有利于成肌干细胞的体外生长和极性分化。扫描电镜初步证实了成肌细胞在PGA表面的良好生物相容性和极性分化潜能,肌管极性生长,融合成肌膜状结构,表明PGA纤维作为支架材料用于体外肌组织构建的可行性。第三章成肌干细胞体外三维及平面培养的比较研究[目的]比较三维与平面培养C2C12细胞形态及功能差异。[方法]Ⅰ型胶原和Matrigel Matrix修饰Sylgard 184铸槽和普通培养皿,分别接种C2C12细胞悬液,细胞增殖至80%融合时,换含2%马血清的DMEM/F12诱导分化获取成熟的肌管；倒置显微镜观察肌管形态,RT-PCR方法检测MyoD、Myogenin基因mRNA的表达,免疫荧光检测成肌特异性蛋白MyoD、Myogenin、Desmin、F-actin、MHC和nAChR等的表达。[结果]Sylgard 184铸槽表面的C2C12细胞诱导分化5d,倒置显微镜下可见肌管融合多核、极性生长趋势；17d后肌管增粗成熟、极性平行,融合形成肌组织类似物,有自主收缩性；扫描电镜见肌管之间排列紧密、重叠,厚0.3mm,具有三维性；而平面培养分化3d后倒置显微镜下可见肌管融合,分化7d达成熟峰值,肌管小而排列紊乱。RT-PCR检测三维和平面培养MyoD、Myogenin mRNA均阳性表达,但三维培养的表达更强；MyoD、Myogenin、Desmin、F-actin、MHC和nAChR等特异性蛋白检测显示,极性肌管内荧光蛋白的表达更密集。[结论]相对于传统的平面培养,三维极性肌管的生存时间、功能表达、肌管间的细胞连接更加优化。三维培养有较高的细胞成活率、肌管呈极性平行分布特征,有利于成肌细胞的体外极性分化和肌管间细胞连接的形成,肌管存活时间长且一管多核,有利于成肌分化因子和收缩蛋白的表达,其结构更接近其生理状态,且无其他细胞或组织成分的干扰,肌管纯度高并具备自主收缩性,进一步研究有望成为骨骼肌的发生发育、应力加载和骨骼肌肌病良好的体外研究模型。