论文部分内容阅读
目的：1.研究NSCLC患者肿瘤组织中EGFR与HER2、CXCR4的相关性及意义。2.构建特异性基因工程抗EGFR单链抗体(scFv)融合蛋白，并对其进行亲和、内化活性分析。3.研究特异性EGFR-scFv纳米分子探针（scFv@GoldMag）在裸鼠体内、外与EGFR阳性细胞结合的特异性。方法：1.选择未经治疗NSCLC原发肿瘤组织标本75例，所有标本均经4%甲醛固定，石蜡常规包埋、切片，按照免疫组化PV两步法对EGFR、HER2及CXCR4进行染色。以PBS做阴性对照，已知阳性片做阳性对照。显微镜下观察EGFR、HER2及CXCR4的表达情况。免疫组化结果分析：采用半定量积分法计数阳性细胞，在光学显微镜高倍视野（×20）下随机选择5个视野，计数500个细胞，根据阳性细胞比例及阳性着色强度，采用的评分标准：阳性细胞数<5%，5%-24%，25%-50%，51%-74%及≥75%,分别判定为0、1、2、3、4分。每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别判定为0、1、2、3分。根据两项积分之和判定结果，0分为阴性(-)，1-2分为弱阳性(+)，3-5分为中等阳性(++)，6-7分为强阳性(+++)。统计学分析：采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析，计数资料采用两个(或多个)样本率比较的检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。检验水准P=0.05。2.构建抗EGFR单链抗体融合蛋白（EGFR-scFv）：将测序正确的抗EGFR单链抗体质粒克隆入原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌E.coli.BL21（DE3），经过IPTG诱导表达后，通过Ni-NTA纯化，应用SDS-PAGE检测EGFR-scFv表达情况，通过Westernblot检测带6×his标签的目的蛋白（EGFR-scFv-His）表达。检测EGFR-scFv融合蛋白体外活性：用含10%胎牛血清（FBS）RPMI1640培养液体外培养EGFR阳性NSCLC（SPC-A1）及EGFR阴性SCLC（H69）细胞株，采用间接免疫荧光和流式细胞术检测EGFR-scFv融合蛋白在细胞中的内化活性。3.构建EGFR特异性纳米金磁探针：将金磁颗粒作为靶向对比剂标记scFv，以非共价键偶联法构建NSCLC特异性分子探针EGFR-scFv@GoldMag。体外实验：在SPC-A1及H69细胞株中，通过激光共聚焦、流式细胞术及透射电镜的方法，检测该探针在EGFR阳性细胞中的内化活性及抗原特异性。体内实验：用含10%胎牛血清（FBS）RPMI1640培养液体外培养SPC-A1及H69细胞，分别皮下注射SPC-A1或H69细胞悬液，构建SPC-A1以及H69细胞荷瘤裸鼠模型，采用透射电镜方法，观察EGFR-scFv@GoldMag探针在裸鼠体内与NSCLC阳性细胞结合的特异性。结果：1.EGFR、HER2及CXCR4在NSCLC组织中的阳性表达率分别为58.66%（44/75），28%（21/75），60%（45/75）。EGFR、HER2及CXCR4在NSCLC中的表达与患者的年龄、性别及组织类型无关（P>0.05），而与患者淋巴转移及远处转移有关（P<0.05）。EGFR与HER2，EGFR与CXCR4，HER2与CXCR4的相关系数分别为r=0.296（P<0.01），r=0.578（P<0.01），r=0.426（P<0.01）。三种基因均无表达、单基因表达、两种基因表达及三种基因联合表达患者中位生存时间分别为18.3月、16.3月、6.3月及3.6月。2.成功制备带6-His标签的抗EGFR单链抗体（EGFR-scFv-His），经SDS-PAGE证实表达成功。经Westernblot证实表达产物带6-His标签。并且该融合蛋白与EGFR阳性的肿瘤细胞株SPC-A1有特异性结合，与EGFR阴性的肿瘤细胞株H69无结合。3.成功构建了NSCLC特异性分子探针scFv@GoldMag，并且该探针与EGFR阳性的肿瘤细胞株SPC-A1有特异性结合，与EGFR阴性的肿瘤细胞株H69无结合。透射电镜观察SPC-A1细胞靠近细胞膜可见较多团块样絮状致密颗粒聚集，而H69细胞附近未见致密颗粒聚集。结论：NSCLC患者组织中存在EGFR、HER2及CXCR4表达，其表达与NSCLC组织类型无关，淋巴结及远处转移的NSCLC患者表达率明显增高，与预后不良有关。EGFR、HER2及CXCR4在NSCLC中的表达均呈正相关，其中EGFR与CXCR4相关性最高。三种基因同时表达预后最差。EGFR-scFv有特异性抗原结合活性并能内化入EGFR阳性肿瘤细胞。成功构建了NSCLC特异性分子探针scFv@GoldMag，并且证实scFv@GoldMag无论在体外培养细胞还是荷瘤裸鼠体内，都能特异性与EGFR阳性细胞结合并内化。该探针在裸鼠体内具有肿瘤组织细胞的靶向特异性，为下一步在体内研究以该探针作为MRI分子探针奠定了基础。