类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis;RA）是一种自身免疫疾病,主要会对关节造成损害,具有较高的致残率为患者和社会带来沉重的负担。肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor;TNF-α）和Janus激酶1（Janus Kinase 1;JAK1）是目前临床用于治疗治疗类风湿性关节炎的两个靶点。本设计利用分子模拟方法从数据库中筛选TNF-α/JAK1双重抑制剂,研究的主要内容及取得的成果如下:1.TNF-α抑制剂筛选药效团构建研究:选取三个TNF-α与其变构抑制剂晶体复合物通过分子动力学模拟分析关键氨基酸以及其与抑制剂间相互作用。对稳定结合轨迹进行聚类分析后,选取聚类集中的代表结构基于受体-配体复合物特征构建药效团模型。随后基于作用方式分析结果对药效团特征进行筛选。分子动力学作用方式分析显示TNF-α关键氨基酸为C链上的Tyr59、Tyr119以及Tyr151,主要作用方式为氢键、疏水以及π-π堆积相互作用。对聚类分析得到的代表结构进行药效团构建后结合关键作用方式进行药效团特征筛选,最后得到3个TNF-α抑制剂筛选药效团模型。2.JAK1分子对接筛选研究:利用JAK1活性抑制剂和诱饵集分子通过Schr（?）dinger软件中SP和XP两种对接程序与5个JAK1蛋白晶体结构进行对接,取对接分数进行ROC曲线分析,分析对接程序以及蛋白模型作为筛选工具的特异性和灵敏度。最后选取SP分子对接程序和PDB编号为6BBU的JAK1蛋白晶体结构对数据库中化合物进行分子对接筛选,共得到9509个化合物。3.双抑制剂筛选与成药性分析研究:将JAK1分子对接筛选得到的化合物分别与3个TNF-α药效团进行匹配后按照Phase screen score值筛选得到2232个化合物。将候选化合物与TNF-α进行分子对接后,取与JAK1蛋白对接分数低于-9.00 kcal/mol和与TNF-α蛋白对接分数低于-11.00 kcal/mol的化合物进行成药性评价。最后通过类药五原则和ADMET筛选共得到8个候选化合物。4.诱导契合对接和元动力学模拟研究:诱导契合对接用来准确预测8个候选化合物与TNF-α/JAK1蛋白的最佳结合构象。对接实验前以分子动力学模拟为主要方法对抑制剂与TNF-α/JAK1蛋白间作用模式进行分析。结果显示TNF-α与抑制剂间关键氨基酸以及作用方式与药效团实验动力学分析结果一致,JAK1抑制剂与关键氨基酸Glu957和Leu959存在较强的氢键作用,与Leu1010形成较强的疏水作用。结合分析得到的关键氨基酸以及作用力对诱导契合对接产生的构象进行筛选,获得8个候选化合物最优构象并进行元动力学模拟。元动力学模拟对8个候选化合物与TNF-α/JAK1蛋白结合构象相对稳定性进行分析后,保留了5个候选化合物。5.分子动力学模拟及结合自由能分析研究:TNF-α/JAK1蛋白与候选化合物复合物通过分子动力学模拟判断化合物与蛋白间关键作用方式的稳定性,结合自由能计算确定化合物是否具有潜在抑制活性。动力学模拟显示水飞蓟宾、恩替卡韦以及化合物5与TNF-α/JAK1蛋白多个关键氨基酸间存在相互作用且动力学模拟过程中较为稳定持续。同时三种化合物与两个靶蛋白具有较低的结合自由能。6.抗炎活性分析:通过构建LPS（Lipopolysaccharide）诱导的RAW 264.7炎症模型,对水飞蓟宾和恩替卡韦抗炎活性进行研究。实验表明水飞蓟宾和恩替卡韦相对于LPS组可明显降低炎症模型中NO表达量,具有抗炎活性且IC50值分别为30.35±9.8和49.45±60.10μΜ。