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随着表征年龄的增加,机体会出现不同程度的炎性改变及异常甲基化状态。这种慢性低度的炎性衰老现象及异常甲基化修饰能损及组织器官,加速衰老及相关老年病的发生。NF-κB/TNF-α介导的炎性通路是引起炎性衰老的主要机制,姜黄素与运动均能通过抑制NF-κB信号改善炎性衰老,但二者的作用机制是否与甲基化的表观遗传调控相关还有待研究。本研究采用增龄小鼠模型,探究其在炎性衰老过程中,关键NF-κB信号蛋白的DNA甲基化水平改变;采取耐力运动干预增龄小鼠,探讨耐力运动能否通过调控衰老小鼠NF-κB信号通路中DNA与组蛋白甲基化水平的表观修饰改善炎性衰老;对衰老小鼠进行姜黄素及耐力运动干预,探讨运动与姜黄素协同作用机制是否存在骨骼肌特异性组蛋白酶SMYD2对炎性衰老NF-κB信号通路的表观调节。实验一:研究方法实验所需不同月龄BALB/C雌性小鼠共20只,正常喂养3个月,对青年小鼠(5月龄组)及增龄衰老小鼠(12月龄组、15月龄组、18月龄组)进行取材,按所需指标分别进行HE染色、Elisa检测、Western blot检测及MSP检测。统计学分析采用Image-Pro Plus 6.0和CurveExpert1.3等软件对图片进行处理并分析;采用SPSS19.0和GraphPad prism 8统计软件对实验数据进行处理及分析。结果中符合正态分布的组间差异,单因素分析采用T检验,双因素分析采用Two-way ANOVA方差分析;不符合正态分布和方差齐性的组间差异,采用秩和检验及Kruskal-Wallis法进行两两分析。研究结果(1)体重与脏器系数:18月龄小鼠体重比5月龄、12月龄组均显著下降(p<0.001);18月龄小鼠卵巢系数比5月龄组明显下降(p<0.05)。(2)组织形态学特点:与5月龄小鼠相比,18月龄小鼠卵巢、肺组织及海马组织均发生了不同程度的炎性浸润。(3)血清炎性因子浓度变化:18月龄小鼠TNF-α浓度比5月龄组高(p<0.001),比12月龄组TNF-α浓度高(p<0.01)。(4)骨骼肌及心肌NF-κB相关蛋白表达:18月龄小鼠骨骼肌p50、TNF-α、COX2水平比5月龄组高(p<0.001),p65水平比5月龄组高(p<0.01),p50、p65水平比12月龄组高(p<0.05),TNF-α水平比12月龄及15月龄组高(p<0.01),p50、COX2水平比15月龄组高(p<0.05);18月龄小鼠心肌p50、p65、TNF-α水平均比5月龄组高(p<0.01),p50、p65、COX2水平均比12月龄组高(p<0.05)。(5)NF-κB信号p50甲基化程度:同5月龄小鼠相比,18月龄小鼠骨骼肌p50基因甲基化率降低(p<0.05)。研究结论(1)增龄小鼠骨骼肌与心肌NF-κB信号蛋白p50、p65、COX2、TNF-α表达水平在高月龄小鼠中高表达,验证了自然衰老小鼠中存在炎性衰老现象;(2)增龄小鼠p50启动子发生了甲基化改变,其可能是炎性衰老小鼠模型发生炎性改变的表观遗传学机制之一。实验二:研究方法实验所需BALB/C雌性小鼠9月龄,12月龄、15月龄各10只,适应性喂养后分组:九月龄运动组E12,九月龄对照组N12,12月龄运动组E15,12月龄对照组N15,15月龄运动组E18,15月龄对照组N18,各5只。其中增龄对照组(N12、N15、N18)正常喂养,运动组(E12、E15、E18)小鼠进行3月运动干预(跑台训练;坡度0%,每周3次,每次60min;速度分别为10m/min、9m/min、8m/min)。干预因素结束后取材,按所需指标分别进行Elisa检测、免疫组化检测、Western blot检测及MSP检测。统计学分析方法同实验一。研究结果(1)血清炎性因子浓度变化:运动后小鼠血清TNF-α浓度未发生显著改变。(2)骨骼肌p65免疫组化:E15小鼠腓肠肌组织p65阳性细胞数比N15小鼠多,E18小鼠腓肠肌与比目鱼肌中p65的阳性细胞数比N18小鼠少。(3)骨骼肌及心肌NF-κB相关蛋白表达:E12小鼠骨骼肌COX2水平比N12小鼠低(p<0.05);E15小鼠骨骼肌p50水平比N15小鼠高(p<0.01),心肌p50水平比N15小鼠低(p<0.01);E18小鼠骨骼肌p50、COX2水平比N18小鼠低(p<0.05)、TNF-α水平比N18小鼠低(p<0.01),心肌p50水平比N18小鼠低(p<0.01)、p65水平比N18小鼠高(p<0.01)。(4)NF-κB信号p50及TNF-α甲基化程度:E18小鼠骨骼肌p50甲基化水平比N18小鼠高,TNF-α甲基化水平无明显变化。研究结论运动干预增龄小鼠骨骼肌p50与TNF-α蛋白表达改变最明显,但仅p50发生甲基化改变,表明耐力运动对p50的甲基化修饰可能是其通过增龄小鼠NF-κB信号改善炎性衰老的机制之一,而其对TNF-α的调控过程不涉及甲基化修饰。实验三:研究方法实验所需BALB/C雌性小鼠2月龄5只,18月龄20只。适应性喂养后分组:年轻对照组YN,老年对照组ON,姜黄素单独干预老年组OC,单纯运动干预老年组OE,姜黄素协同运动干预老年组OCE,各5只。其中OE、OCE小鼠进行1个月运动干预(跑台训练,坡度0%,每周3次,每次60min;速度为8m/min),OC、OCE小鼠腹腔注射姜黄素混悬液1个月(每周5次,按100mg/kg剂量进行注射)。按各因素干预后取材,按所需指标分别进行HE染色、Elisa检测、免疫荧光检测、Western blot检测及MSP检测。统计学分析方法同实验一。研究结果(1)组织形态学特点:腹腔注射姜黄素未致衰老小鼠肝脏损伤,OCE组小鼠肝脏炎性浸润程度轻于OC及OE组。(2)血清炎性因子浓度变化:OCE小鼠血清TNF-α浓度比ON小鼠低(p<0.001),IL-1β浓度比OE高(p<0.01)。(3)免疫双标SMYD2/p65共表达情况:OCE小鼠骨骼肌比ON小鼠增强(p<0.001),比OC小鼠增强(p<0.01),比OE小鼠增强(p<0.05);OCE小鼠心肌比OC小鼠减弱(p<0.01)。(4)骨骼肌及心肌NF-κB相关蛋白表达:OCE小鼠骨骼肌SMYD2、H3K36me2水平比ON小鼠高(p<0.01),p65、SMYD2、H3K36me2水平比OC小鼠高(p<0.05);OCE小鼠心肌TNF-α水平比ON小鼠低(p<0.05),SMYD2水平比ON及OC小鼠高(p<0.01)。(5)NF-κB信号p50及p65甲基化程度:OCE小鼠骨骼肌p50甲基化程度比ON及OC小鼠高;p65甲基化水平无明显变化。研究结论(1)姜黄素协同耐力运动能调节老龄小鼠骨骼肌与心肌组织p50甲基化程度,其可能是该协同作用对炎性衰老的DNA甲基化调节机制之一;(2)姜黄素协同耐力运动通过SMYD2介导的组蛋白甲基化抑制SMYD2-H3K36me2-RelA/p65-TNF-α通路,也可能是其调控炎性衰老的表观遗传机制之一。