论文部分内容阅读
微囊泡(MVs)是从细胞表面以出芽的方式脱落到细胞外环境中的异质膜结合性纳米囊泡(100-1000 nm),目前已被广泛认为是各种癌症早期诊断非常有应用前景的“生物指纹”。整个MVs群体的定量检测有助于我们从一个全新的角度深度理解细胞内和细胞间的通讯过程(包括转运,分泌和受体介导的信号转导等)。同时,通过分析MVs的总体水平,可以进一步阐释MVs形成和清除的潜在调节机制,因而可以帮助我们更加深入地理解和挖掘各种MVs浓度异常疾病的发病机理。癌细胞来源MVs的高性能检测则在癌症的早期诊断中起着至关重要的作用。然而,由于MVs独特的理化特性,目前MVs的高性能检测在技术上仍然具有挑战性。传统的MVs检测方法如纳米颗粒跟踪分析(NTA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等往往具有检测灵敏度低、样品和试剂消耗量大、检测时间长等缺点,因而并不能满足实际临床应用的需求。随着现代纳米技术的迅速发展,还原氧化石墨烯(RGO)场效应晶体管生物传感器(FET)因其免标记检测、灵敏度高、特异性好、分析速度快、样品和试剂消耗低、测试成本低、易于小型化和集成化等优点而在各种生物传感器平台中脱颖而出。据报道,RGO-FET生物传感器可用于各种生物分子的高灵敏度检测,如核酸、蛋白质、神经递质、病毒、细菌及其代谢产物、抗生素和气体分子等。然而,目前尚无使用RGO-FET生物传感器检测MVs的报道。因而,RGO-FET非常有希望成为检测MVs的有力工具,在未来的临床应用中也有广阔的应用前景。基于以上现状和挑战,本论文中构建了两种功能化的RGO-FET生物传感器并将其分别用于MVs总体水平的高灵敏检测以及肝癌细胞来源MVs(HepG2-MVs)的高灵敏度、高特异性、免标记检测,具体开展的工作如下:第一部分基于膜生物素化策略的RGO-FET生物传感器用于MVs的超灵敏检测本章中我们成功构建了一种链霉亲和素(SA)功能化的RGO-FET生物传感器并基于生物素化策略将其应用于MVs总体水平的高灵敏度检测。该传感器平台以RGO作为传感纳米材料,在以传统的标准半导体技术制备得到FET芯片后,以滴涂的方式将RGO固定到沟道中即可得到RGO-FET生物传感器。由于MVs表面缺乏公认的通用蛋白标志物,首先对其进行生物素化处理(培养细胞时加入生物素化磷脂衍生物并对细胞培养上清液进行离心即可得到生物素化MVs,B-MVs)。为了利用RGO-FET生物传感器实现对B-MVs的检测,对其进行表面功能化,即通过化学连接剂的作用,将SA修饰到芯片的表面。由于B-MVs上的生物素与SA可以发生特异性结合,因而B-MVs可以被特异性地捕获到芯片表面。B-MVs带负电,RGO-FET为p型器件,因而当B-MVs结合到芯片表面时,可以对RGO产生n型掺杂,进而引起电信号的改变(转移特性曲线中狄拉克点的变化)。该平台可以实现10~5 particles/mL至10~9 particles/mL浓度范围内的B-MVs检测,检测限低至20 particles/μL。此外,该平台具有良好的特异性,可以避免其他非特异性物质对检测产生的干扰。该平台还具有良好的通用性(可以实现对多种细胞来源的B-MVs的检测)和抗干扰能力(可以实现血清中B-MVs的检测)。以上所有结果表明,该SA功能化的RGO-FET生物传感器为生物医学研究中MVs总体水平的分析提供了一种全新的、可靠的检测策略和检测平台。第二部分双适配体功能化的RGO-FET生物传感器用于免标记、特异性检测HepG2细胞来源的MVs本章研究旨在构建双适配体功能化的RGO-FET生物传感器,从而实现对肝癌细胞衍生MVs(HepG2-MVs)的高特异性、高灵敏度检测。首先,用差速离心的方法从HepG2细胞培养上清液中分离纯化HepG2-MVs。为了实现在RGO-FET生物传感器平台上对HepG2-MVs的高灵敏度检测,在制备得到RGO-FET生物传感器后,利用化学还原反应在RGO表面原位沉积AuNPs。随后,利用Au-S键将TLS11a和EpCAM适配体同时修饰到沉积有AuNPs的芯片表面,最终实现了双适配体功能化的RGO-FET生物传感器(AAP-GFET)的构建。HepG2-MVs带负电荷,RGO-FET为p型器件,因而当HepG2-MVs被修饰到芯片表面的适配体探针所特异性捕获时,HepG2-MVs表面的负电荷则可以对RGO产生n型掺杂,从而引起电学信号的变化(转移特性曲线中狄拉克点的变化)。该AAP-GFET生物传感器可实现对PBS中HepG2-MVs的高灵敏度检测,检测限低至84 particles/μL。该AAP-GFET生物传感器还表现出良好的特异性,可有效避免肝癌相关血清蛋白和其他细胞来源MVs的干扰。此外,基于双适配体的生物传感界面大大增强了生物传感信号,有效地提升了传感器的检测灵敏度。最终,将AAP-GFET生物传感器应用于实际临床血液样品中HepG2-MVs的检测,我们成功将肝细胞癌(HCC)患者与健康人区分开来。以上所有结果表明,该双适配体功能化的RGO-FET生物传感器平台有望成为HCC早期诊断的有力工具。