拉帕醇抑制食管鳞癌细胞增殖的作用及其机制研究

来源 :郑州大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:suiyuehenji
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的和背景:食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,其发病率位于全球恶性肿瘤发病率的第八位,死亡率位于第六位。在食管癌进展过程中,许多信号通路中的激酶发生变化并进行调节。90-kDa核糖体S6激酶(RSK1-4)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,参与转录、翻译、细胞周期调控和细胞存活。RSK的表达和激活在乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤中均存在失调,RSK已被报道可能是一种有前途的癌症治疗靶点。SL0101及其类似物等是已报道的RSK抑制剂,虽然他们在乳腺癌中具有生长抑制作用但是在非小细胞肺癌中也被证明具有促进侵袭的作用。因此,寻找更有效的RSK抑制剂仍然十分重要。已有研究表明,醌类化合物具有抗疱疹、抗登革热和抗肿瘤等多种药理活性。拉帕醇又名黄钟花醌,最初是从南美洲的天然产物的TabebuliaAvellanedae中提取出来,属于萘醌类化合物并且具有抗炎、抗病毒和抗癌的作用。有研究报道拉帕醇通过靶向丙酮酸激酶M2(PKM2)抑制黑色素瘤细胞的生长,拉帕醇通过靶向DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ抑制胶质瘤细胞的生长。然而,拉帕醇在食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中是否具有抗癌活性尚未阐明。方法:1.探索拉帕醇在ESCC细胞株中潜在的分子作用靶点。(1)Western blot实验,检测拉帕醇在JB6和KYSE30细胞内潜在的分子靶点。(2)体外激酶实验,检测拉帕醇对RSK2激酶活性的影响。(3)Pulldown实验,检测拉帕醇与重组蛋白RSK2是否结合?2.探索RSK在ESCC中的表达以及其生物学意义。(1)Western blot实验,检测检测磷酸化RSK,在SHEE、KYSE30、KYSE450和KYSE510细胞中的表达情况。(2)设计shRNA敲低RSK2基因,并用PCR和Western blot实验进行验证。(3)细胞增殖实验(cellproliferationassay)和软琼脂糖克隆实验(soft agar assay),检测敲低RSK2基因对细胞增殖和克隆形成的影响。3.探索拉帕醇对ESCC细胞株增殖和克隆形成的影响。(1)细胞增殖实验,检测不同剂量的拉帕醇(0μM、5 μM、10μM、20 μM)对ESCC细胞株增殖的影响。(2)Softagar实验,检测不同剂量的拉帕醇(0μM、5 μM、10μM、20μM)对克隆形成的影响。(3)Western blot实验检测拉帕醇对周期相关蛋白的影响。4.探索拉帕醇对ESCC细胞系增殖的抑制作用是否依赖于RSK2的表达。(1)细胞增殖实验,检测不同剂量的拉帕醇(0 μμM、5 μM、10 μM、20 μM),在shRSK2细胞系中对生长的抑制作用。(2)Softagar实验,检测不同剂量的拉帕醇(0 μM、5μM、10 μM、20μM)在shRSK2细胞中,对克隆形成的抑制作用,两周之后电子显微镜拍照,Image-Pro PLUS对菌落记数。5.探索拉帕醇是否促进ESCC细胞系KYSE30和KYSE450发生凋亡。(1)流式细胞术分析,检测不同剂量的拉帕醇(0μM、20 μM、40μM)对ESCC细胞凋亡的影响。(2)Western blot实验,检测拉帕醇对凋亡相关蛋白的影响。结果:1.(1)Western blot实验结果显示,拉帕醇在JB6和KYSE30细胞抑制RSK2下游蛋白分子p-CREB、p-ATF1和p-Histone H3的表达。(2)体外激酶实验显示,拉帕醇通过抑制p-ATF1的表达,抑制RSK2激酶的活性。(3)Pull down实结果表明,拉帕醇直接和重组蛋白RSK2结合。综合以上实验结果我们得出结论RSK2是拉帕醇的分子靶点。2.(1)Western blot实验结果显示,与SHEE细胞相比p-RSK在ESCC细胞系中高表达(2)PCR和Western blot结果显示RSK2基因在ESCC细胞系中被成功敲除。(3)Cell proliferation和soft agar实验结果表明,敲低RSK2之后抑制细胞增殖和克隆的形成。3.(1)细胞增殖实验结果表明,拉帕醇剂量依赖性地抑制ESCC细胞株KYSE30、KYSE450 和KYSE510的增殖。(2)Soft agar实验结果表明,拉帕醇剂量依赖性地抑制ESCC细胞株KYSE450和KYSE510克隆的形成。(3)Western blot结果表明,拉帕醇降低细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1、CyclinD3的表达。4.(1)和(2)实验结果表明,拉帕醇对ESCC细胞株增殖和克隆形成的抑制作用赖于RSK2蛋白的表达。5.(1)流式实验结果表明,拉帕醇剂量依赖性地的诱导ESCC细胞株KYSE30和KYSE450发生早期和晚期凋亡。(2)Western blot实验结果表明,拉帕醇促进促凋亡蛋白的表达,如 Cleavedcaspase 7、Cleavedcaspase 3、Cleaved PARP、Cytochrome C 和 BAX 的表达。结论:拉帕醇通过靶向RSK2抑制ESCC细胞株的生长,并诱导ESCC细胞株发生内源性凋亡。
其他文献
目的:通过整理分析导师应用经方治疗胃食管反流病的病案,总结导师临床治疗经验;并通过对近十年经方治疗胃食管反流病的相关文献进行归纳统计,为基于“通降”理论应用经方辨治本病的治疗理念提供文献数据支持。材料与方法:首先整理分析跟师学习期间收集的有效胃食管反流病病例,对导师临床运用经方辨治本病的诊疗思路及用药规律进行归纳总结,其次检索并整理近十年以经方单方或合方治疗胃食管反流病的相关文献,对经方及药物进行
植物NADPH氧化酶是巨噬细胞NADPH氧化酶gp91phox的同源物,其一般以基因家族的形式存在。研究表明,植物NADPH氧化酶在生物和非生物胁迫中起重要的作用;但其在柑橘逆境响应中的作用尚不清楚。因此,本研究通过生物信息学筛选了甜橙NADPH氧化酶基因家族成员;采用qRT-PCR方法分析其在甜橙不同组织、不同逆境胁迫与激素处理下的基因表达特性;通过病毒诱导的基因沉默方法初步分析NADPH氧化酶
研究背景和目的:依据最新版头颈肿瘤WHO分类中的定义,鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种发生在鼻咽部黏膜在光镜下或超微结构中表现为鳞状分化改变的一种癌。具有
歌唱艺术是一门歌唱心理艺术。歌唱离不开知觉、感觉、意识、意志、记忆、想像、情感、气质、思维等重要心理因素,歌唱心理自始至终都影响和支配着演唱技能、技巧,以及艺术情
目的胶质瘤属神经外科常见疾病,也是发病率最高的原发性中枢性神经系统肿瘤。临床上针对胶质瘤的治疗,目前首选方式依然是显微镜下最大限度切除肿瘤组织后辅以放、化疗。但是
背景:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界范围内常见的消化系统恶性肿瘤,发病率逐年攀升,其中位生存时间为6-20个月,是全世界癌症相关死亡的第三大主要病因。
当今时代,知识经济加速发展,企业社会责任(CSR)也愈发受到重视。在企业的经营管理方面,传统的成果主义、目标管理等逻辑分析型管理方式已然捉襟见肘。对新时代的企业来说,如
佛教作为世界三大宗教之一,在人类社会发展过程中起着非常的重要作用。佛教建筑作为佛教文化的载体和佛教精神的物化,在佛教的流传和发展中起很重要的作用。佛教传入中国后便受传统文化的同化作用形成了具有中国特色的佛寺建筑,成为了中国古代建筑一个重要的分支和代表。进入现代社会,随着经济社会的多元发展,以及人们生活方式的改变、节奏的加快,佛寺建筑已经不能完全满足现代人民生活和精神的需要,人们对佛寺建筑的发展提出
砂土在动荷载作用下的动力特性一直是学术界和工程界关注的热点,目前关于纯砂动力特性已有较多研究,但工程中的砂土时常含有细粒,其在波浪荷载等复杂应力路径下的动力特性还不清楚,为加强对相关问题的认识,本文使用空心扭剪仪(HCA)研究了动三轴、动扭剪以及圆耦合三种应力路径下含细粒饱和砂土的动力特性,主要结论如下:(1)应力路径对孔压增长规律、液化周次(Nf)有着明显的影响。其中,动三轴、动扭剪应力路径试验
目的:近些年来肺癌的发病率与死亡率在逐年增长,不仅严重危害人类的健康,还对社会经济造成了一定的负担。肺癌的治疗手段有手术、放化疗、靶向药物、免疫治疗、中药治疗等。