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目的和背景:食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,其发病率位于全球恶性肿瘤发病率的第八位,死亡率位于第六位。在食管癌进展过程中,许多信号通路中的激酶发生变化并进行调节。90-kDa核糖体S6激酶(RSK1-4)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,参与转录、翻译、细胞周期调控和细胞存活。RSK的表达和激活在乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤中均存在失调,RSK已被报道可能是一种有前途的癌症治疗靶点。SL0101及其类似物等是已报道的RSK抑制剂,虽然他们在乳腺癌中具有生长抑制作用但是在非小细胞肺癌中也被证明具有促进侵袭的作用。因此,寻找更有效的RSK抑制剂仍然十分重要。已有研究表明,醌类化合物具有抗疱疹、抗登革热和抗肿瘤等多种药理活性。拉帕醇又名黄钟花醌,最初是从南美洲的天然产物的TabebuliaAvellanedae中提取出来,属于萘醌类化合物并且具有抗炎、抗病毒和抗癌的作用。有研究报道拉帕醇通过靶向丙酮酸激酶M2(PKM2)抑制黑色素瘤细胞的生长,拉帕醇通过靶向DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ抑制胶质瘤细胞的生长。然而,拉帕醇在食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中是否具有抗癌活性尚未阐明。方法:1.探索拉帕醇在ESCC细胞株中潜在的分子作用靶点。(1)Western blot实验,检测拉帕醇在JB6和KYSE30细胞内潜在的分子靶点。(2)体外激酶实验,检测拉帕醇对RSK2激酶活性的影响。(3)Pulldown实验,检测拉帕醇与重组蛋白RSK2是否结合?2.探索RSK在ESCC中的表达以及其生物学意义。(1)Western blot实验,检测检测磷酸化RSK,在SHEE、KYSE30、KYSE450和KYSE510细胞中的表达情况。(2)设计shRNA敲低RSK2基因,并用PCR和Western blot实验进行验证。(3)细胞增殖实验(cellproliferationassay)和软琼脂糖克隆实验(soft agar assay),检测敲低RSK2基因对细胞增殖和克隆形成的影响。3.探索拉帕醇对ESCC细胞株增殖和克隆形成的影响。(1)细胞增殖实验,检测不同剂量的拉帕醇(0μM、5 μM、10μM、20 μM)对ESCC细胞株增殖的影响。(2)Softagar实验,检测不同剂量的拉帕醇(0μM、5 μM、10μM、20μM)对克隆形成的影响。(3)Western blot实验检测拉帕醇对周期相关蛋白的影响。4.探索拉帕醇对ESCC细胞系增殖的抑制作用是否依赖于RSK2的表达。(1)细胞增殖实验,检测不同剂量的拉帕醇(0 μμM、5 μM、10 μM、20 μM),在shRSK2细胞系中对生长的抑制作用。(2)Softagar实验,检测不同剂量的拉帕醇(0 μM、5μM、10 μM、20μM)在shRSK2细胞中,对克隆形成的抑制作用,两周之后电子显微镜拍照,Image-Pro PLUS对菌落记数。5.探索拉帕醇是否促进ESCC细胞系KYSE30和KYSE450发生凋亡。(1)流式细胞术分析,检测不同剂量的拉帕醇(0μM、20 μM、40μM)对ESCC细胞凋亡的影响。(2)Western blot实验,检测拉帕醇对凋亡相关蛋白的影响。结果:1.(1)Western blot实验结果显示,拉帕醇在JB6和KYSE30细胞抑制RSK2下游蛋白分子p-CREB、p-ATF1和p-Histone H3的表达。(2)体外激酶实验显示,拉帕醇通过抑制p-ATF1的表达,抑制RSK2激酶的活性。(3)Pull down实结果表明,拉帕醇直接和重组蛋白RSK2结合。综合以上实验结果我们得出结论RSK2是拉帕醇的分子靶点。2.(1)Western blot实验结果显示,与SHEE细胞相比p-RSK在ESCC细胞系中高表达(2)PCR和Western blot结果显示RSK2基因在ESCC细胞系中被成功敲除。(3)Cell proliferation和soft agar实验结果表明,敲低RSK2之后抑制细胞增殖和克隆的形成。3.(1)细胞增殖实验结果表明,拉帕醇剂量依赖性地抑制ESCC细胞株KYSE30、KYSE450 和KYSE510的增殖。(2)Soft agar实验结果表明,拉帕醇剂量依赖性地抑制ESCC细胞株KYSE450和KYSE510克隆的形成。(3)Western blot结果表明,拉帕醇降低细胞周期蛋白CyclinB1、CyclinD1、CyclinD3的表达。4.(1)和(2)实验结果表明,拉帕醇对ESCC细胞株增殖和克隆形成的抑制作用赖于RSK2蛋白的表达。5.(1)流式实验结果表明,拉帕醇剂量依赖性地的诱导ESCC细胞株KYSE30和KYSE450发生早期和晚期凋亡。(2)Western blot实验结果表明,拉帕醇促进促凋亡蛋白的表达,如 Cleavedcaspase 7、Cleavedcaspase 3、Cleaved PARP、Cytochrome C 和 BAX 的表达。结论:拉帕醇通过靶向RSK2抑制ESCC细胞株的生长,并诱导ESCC细胞株发生内源性凋亡。