一、研究背景：随着人类社会工业文明的发展,各种创伤、人口老龄化和糖尿病患者的增多,难愈性创面越来越多并逐渐成为医疗系统的负担。另外,医生还常面临各种肿瘤术后创面和各种外科术后继发创面。多年来,创伤研究工作者运用组织病理学、药物学、组织工程学以及外科学等手段对创面修复的发生机制、实验与临床治疗等多方面进行了研究,取得了一定的成就,但由于缺乏合适的创面动物模型及临床创面的多样性和复杂性等原因,在相当长的一段时间内,创面修复研究方面似无重大进展。目前临床上对于浅表创面,普遍采用换敷治疗,治疗时间长,疗效欠佳,纱布容易被渗出物浸湿,导致污染和再感染,需要频繁更换敷料。对于深在的创面或腔隙多采用引流管引流,无论主动或被动引流,均借助引流管端孔及有限侧孔引流,不可能做到与引流腔的充分接触,是一种点状或多点状引流,且引流管裸露于引流腔内,很容易被堵塞。当严重创伤合并大面积复合组织缺损时,传统方法是先行创面清创、无菌敷料包扎、伤口反复换药,待炎症控制,创面新鲜,肉芽生长良好后再行植皮或皮瓣移植术修复封闭创面和组织缺损。其缺点在于伤口渗出较多,引流不畅,渗出物积聚于创面,肉芽组织生长缓慢,疗程长；而皮瓣手术由于难度大,对器材和人员的要求较高,同时由于手术操作复杂、耗时长,对于伤情较重的患者往往也难以承受,甚至有加重病情的可能。负压封闭引流技术(vacuum-assisted closure,VAC)是治疗各种急慢性难愈性创面的新方法。已经广泛应用于创伤外科、骨科、普外科、烧伤科等科室的各类急慢性创面,并取得了良好的疗效。其被推荐用于各种急慢性创面的辅助治疗,包括压力性创面,糖尿病足,下肢创面,外科切口,肿瘤切除后创面,烧伤创面,感染创面,坏死性筋膜炎,感染性胸骨创面等。证明其是一种简单、经济促进创面愈合的纯物理疗法,具有创面愈合快、感染率低、更换敷料次数少等优点。人工真皮已经被广泛地应用于临床。临床及动物研究证实其不仅可以帮助修复各种皮肤全层缺损,对于肌腱外露和骨外露的创面修复也有疗效。人工真皮移植手术操作简便快捷,易于推广,手术成功率高,可以有效修复创面,防止创面感染。由于手术时间短,对患者的伤情也不会有太大影响。因为一期手术后已经有类真皮组织形成,在二期手术自体断层皮片移植成活后,可以形成类似全厚植皮的效果。与皮瓣相比并无臃肿,手术后皮片的挛缩程度轻,一般不会对功能造成太大影响,多数不需要再行手术治疗。对供区而言,由于只切取了薄断层皮片,供皮区一般只会遗留轻度的色素改变,不会出现瘢痕增生,与皮瓣的供瓣区相比,其优点更为明显。负压封闭引流技术和人工真皮移植是近年来出现的一种新的创面处理技术,可用于各种急、慢性创面治疗。临床上所见的创面通常都伴有不同程度的感染,能否通过负压封闭引流清除这些感染创面的细菌并控制感染,为进一步人工真皮移植提供良好的创基?负压封闭引流能否促进人工真皮的血管胶原化进程,提高人工真皮移植的成活率?将负压封闭引流技术与人工真皮移植联合,充分利用各自的优点作为一种新的治疗创面的方法是否可行?本课题的研究旨在探讨负压封闭引流联合人工真皮移植治疗难愈性创面的可行性,从细胞和分子水平探索该联合治疗方法促进创面愈合的可能机制,为临床难愈性创面提供一种新的治疗方法,同时为该联合治疗的进一步研究和临床应用提供理论和实践依据。二、研究目的：观察负压封闭引流技术对创面基底条件及人工真皮移植后类真皮组织形成的影响；探讨人工真皮移植联合负压封闭引流技术治疗创面的可行性,为其进一步研究和临床应用提供理论和实践依据；最后将负压封闭引流联合人工真皮自体表皮移植用于临床难愈性创面修复,观察其治疗效果。三、材料和方法：第一部分：实验研究动物实验一：共120只SD大鼠。其中80只SD大鼠背部各制作一直径3cm圆形创面,接种金黄色葡萄球菌制作感染创面模型后分为实验组和对照组,每组40只。实验组创面实施负压封闭引流手术并在-120--125mmHg条件下持续吸引；对照组创面常规盐水纱块湿敷换药。观察创面细菌接种及治疗前后创面分泌物情况及肉芽组织生长情况；测量治疗后第4天和第8天新生肉芽组织量。另40只SD大鼠,背部各制作一直径3cm圆形创面,接种金黄色葡萄球菌制作感染创面模型后分为实验组和对照组,每组20只。实验组创面实施负压封闭引流手术并在-120--125mmHg条件下持续吸引；对照组创面常规盐水纱块湿敷换药。分别于治疗后第4天和第8天取组织标本行HE染色观察肉芽组织形态,并对创面治疗前后进行细菌学检测。动物实验二：40只SD大鼠背部各制作一直径3cm圆形创面,接种金黄色葡萄球菌制作感染创面模型后行负压封闭引流手术并在-120--125mmHg条件下持续吸引。待创面肉芽组织新鲜生长后移植人工真皮,随后将其分为实验组和对照组,每组20只。实验组创面继续在-120--125mmHg条件下持续吸引治疗,对照组创面常规盐水纱块加压包扎换药。大体肉眼观察人工真皮血管胶原化进程；并分别于真皮移植后即刻、4天和8天于创面取材。1通过CD34免疫组化的结果行血管内皮细胞(vascular endothelial cell,VEC)计数；2采用Masson染色方法观察移植床底胶原纤维形态并进行成纤维细胞计数；3采用免疫组化染色方法检测组织标本Ki-67抗原表达,观察增生期细胞并计数；4组织匀浆后以ELISA法检测创面组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量；5创面组织行细菌学检测。第二部分：临床研究对2012年3月～2013年9月收治的23例难愈性创面住院患者应用负压封闭引流联合人工真皮自体表皮修复创面,以此评价该方法修复难愈性创面的临床疗效。四、结果：第一部分：实验研究动物实验一：1.负压封闭引流可以促进创面肉芽组织新鲜生长。创面新生肉芽组织量随时间变化而变化(F=6.149,P=0.018),时间存在主效应(F=377.603,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=258.167,P=0.000)。实验组和对照组创面新生肉芽组织量均随时间变化而变化,均在增加(P<0.05)。治疗后第4天,实验组创面新生肉芽组织2.4ml,而对照组创面新生肉芽组织1.8ml,结果显示差异有统计学意义(t=14.634,P=-0.000)；治疗后第8天,实验组创面新生肉芽组织3.6ml,而对照组创面新生肉芽组织2.7ml,结果显示差异有统计学意义(t=9.652,P=0.000)。治疗后第4天和第8天,实验组创面比对照组创面新生肉芽组织量均增加。2.负压封闭引流可以促进感染创面细菌清除。创面细菌含量随时间变化而变化(F=3247.263,P=0.000),时间存在主效应(F=7260.152,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=6016.198,P=0.000)。实验组和对照组创面细菌含量均随时间变化而变化,均在下降(P<0.05)。治疗后第4天,实验组创面细菌量为4.0×107/每克组织,而对照组创面细菌量为4.0×108/每克组织,显示差异有统计学意义(t=-34.325,P=0.000)；治疗后第8天,实验组创面细菌计数值为3.6×104/每克组织,而对照组创面细菌计数值为8.0×107/每克组织,结果显示差异有统计学意义(t=-109.083,P=0.000)。治疗后第4天和第8天,实验组创面比对照组创面细菌含量均减少。动物实验二：1.负压封闭引流可促进人工真皮血管胶原化进程,治疗后8天即可见人工真皮成活,呈淡红色,表层硅胶膜与胶原海绵层开始分离：而对照组真皮移植后第8天人工真皮外观与移植术第4天相比无明显变化,外观呈深红色,表层硅胶模与胶原海绵层仍粘贴紧密。2.实验组创面移植床底胶原纤维数量较对照组显著增多。创面移植床底VEC计数随时间变化而变化(F=1426.371,P=0.000),时间存在主效应(F=3119.444,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=2397.294,P=0.000)。实验组和对照组创面移植床底VEC计数均随时间变化而变化,均在增加(P<0.05)。人工真皮移植后第4天,实验组创面VEC计数较对照组升高,结果显示差异具有统计学意义(t=14.666,P=0.000)。人工真皮移植后第8天,实验组创面VEC计数持续升高,与对照组创面VEC计数相比,结果显示差异有统计学意义(t=45.330,P=0.000)。人工真皮移植后第4天和第8天,实验组创面比对照组创面移植床底VEC计数均增加。创面移植床底成纤维细胞计数随时间变化而变化(F=245.726,P=0.000),时间存在主效应(F=1055.623,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=406.302,P=0.000)。人工真皮移植后第4天,实验组创面移植床底胶原纤维较前增生,成纤维细胞计数较对照组增加,结果显示差异具有统计学意义(t=18.801,P=0.000)。人工真皮移植后第8天,实验组创面移植床底胶原纤维增生,胶原排列紧密；而对照组创面移植床底胶原纤维较前增生,胶原结构疏松。实验组成纤维细胞计数较对照组增加,结果显示差异具有统计学意义(t=21.509,P=0.000)。人工真皮移植后第4天和第8天,实验组比对照组创面移植床底成纤维细胞计数均增加。3.创面VEGF含量随时间变化而变化(F=1222.907,P=0.000),时间存在主效应(F=1782.206,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=1232.433,P=0.000)。实验组和对照组创面VEGF含量均随时间变化而变化,均在增加(P<0.05)。人工真皮移植后第4天,实验组创面VEGF含量较对照组升高,结果显示差异具有统计学意义(t=25.156,P=0.000)。人工真皮移植后第8天,实验组创面VEGF含量较对照组创面VEGF含量增加,结果显示差异有统计学意义(t=58.821,P=0.000)。人工真皮移植后第4天和第8天实验组比对照组创面VEGF含量均增加。创面移植床底的增生期细胞数量随时间变化而变化(F=1068.889,P=0.000),时间存在主效应(F=1459.412,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=2127.536,P=0.000)。实验组和对照组创面移植床底的增生期细胞数量均随时间变化而变化,均在增加(P<0.05)。人工真皮移植后第4天,实验组创面移植床底的增生期细胞数量较对照组升高,结果显示差异具有统计学意义(t=35.509,P=0.000)。人工真皮移植后第8天,实验组创面移植床底增生期细胞数量与对照组创面移植床底增生期细胞数量相比,结果显示差异具有统计学意义(t=41.038,P=0.000)。人工真皮移植后第4天和第8天实验组比对照组创面移植床底的增生期细胞数量均增加。4.创面TNF-α含量随时间变化而变化(F=14.479,P=0.000),时间存在主效应(F=86.337,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=24.706,P=0.000)。实验组和对照组创面TNF-α含量均随时间变化而变化,均在下降(P<0.05)。人工真皮移植后第4天,实验组创面的TNF-α含量较对照组降低,结果显示差异具有统计学意义(t=-3.574,P=0.001)。人工真皮移植后第8天,对照组创面TNF-α含量仍高于实验组,结果显示差异有统计学意义(t=-6.054,P=0.000)。人工真皮移植后第4天和第8天实验组比对照组创面TNF-α含量均下降。创面IL-6含量随时间变化而变化(F=15.924,P=-0.000),时间存在主效应(F=168.997,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=15.247,P=0.000)。实验组和对照组创面IL-6含量均随时间变化而变化,均在下降(P<0.05)。人工真皮移植后第4天,实验组创面的IL-6含量较对照组降低,结果显示差异具有统计学意义(t=-4.322,P=0.000)。人工真皮移植后第8天,对照组创面IL-6含量仍高于实验组,结果显示差异具有统计学意义(t=-4.940,P=0.000)。人工真皮移植后第4天和第8天,实验组比对照组创面IL-6含量均下降。5.创面细菌含量随时间变化而变化(F=1707.123,P=0.000),时间存在主效应(F=7229.979,P=0.000),各组之间也存在主效应(F=6175.497,P=0.000)。实验组和对照组创面细菌含量均随时间变化而变化,均在下降(P<0.05)。治疗后第4天,实验组创面细菌量为2.8×103/每克组织,而对照组创面细菌量为2.0×104/每克组织,结果显示差异有统计学意义(t=--71.624,P=0.000)；治疗后第8天,实验组创面细菌计数值为5.0×102/每克组织,而对照组创面细菌计数值为7.6×103/每克组织,结果显示差异有统计学意义(t=--95.499,P=0.000)。第二部分：临床研究临床病例治疗效果显著。创面清洁迅速,肉芽组织快速生长,为下一步移植人工真皮治疗创造了有利条件。患者平均住院36天。平均负压吸引14天培养肉芽组织后行人工真皮移植。22例(95.7%)人工真皮和随后的二期自体表皮移植均获得成功。人工真皮成活所需时间平均为14天,未见人工真皮溶解坏死。1例患儿创面位于会阴部,人工真皮感染移除,后经肌皮瓣手术成功修复创面。供区均顺利上皮化愈合,平均愈合时间为9天。创面换药次数明显减少,患者感到舒适。随访6-12个月,所有应用该方法治愈的创面皮片色泽良好,质地柔软,耐磨,无挛缩,无继发功能障碍。供区愈合外观佳,创面无复发。五、结论：1.负压封闭引流可以促进创面肉芽组织生长,促进感染创面细菌清除。为人工真皮移植提供良好的创基条件。2负压封闭引流可通过其生物学效应(控制感染、减轻炎症反应、诱导组织细胞增殖)来促进人工真皮血管胶原化进程,缩短人工真皮血管胶原化所需时间,提高移植成功率。3.创面负压封闭引流技术联合人工真皮移植是一种安全、简便、有效的处理创面的理想方法,特别适用于各种难愈性创面的治疗。