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近年来,基于多种基因编辑工具创造的优异动植物种质材料与品种以及矫正、治疗的一些遗传性疾病让人充满期待。以CRISPR系统为代表的基因编辑技术不断创新发展,目前,在第三代基因编辑技术(CRISPR)基础上,进一步衍生出了单碱基基因编辑系统。一般,根据融合的不同脱氨酶种类可将碱基编辑器分为两种类型,即胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editors,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editors,ABEs)。碱基编辑器在不引入基因组双链断裂(Double-strand break,DSB)的情况下,可以通过催化碱基脱氨反应而诱导特定位点的单碱基替换。与CRISPR-Cas9相比,碱基编辑器编辑效率更高而脱靶效应更少。目前,国内外已有多个课题组将其应用于细胞、动植物个体的基因编辑。由于与家畜许多重要经济性状相关的基因突变都是单碱基突变,因此,可以利用单碱基编辑器作为分子育种手段,引入预期靶位点的突变。本实验室曾利用BE3成功将点突变引入滩羊的SOCS2基因,且编辑效率高达75%,说明将碱基编辑器用于大型哺乳动物基因编辑具有可行性。这为ABEs应用于家畜分子育种提供了实例和技术基础。FecB基因是控制绵羊高繁殖力的主效基因之一。该基因具有诱导母羊卵泡颗粒细胞分化、促进卵泡发育,增加卵巢排卵数的功能。研究表明,该基因的点突变(g.A746G,p.Q249R)致使骨形态发生蛋白受体(Bone Morphogenetic Protein,BMP)高度保守区域中的谷氨酰胺突变为精氨酸。本实验室在前期的试验中,利用CRISPR-Cas9系统将m RNA和单链寡核苷酸(ss ODN)供体序列共同注射到山羊和绵羊受精卵中,成功获得了引入预期点突变的结果,可是编辑效率并不高,分别是24%和23.8%。本试验旨在利用体外转录及显微注射技术,将ABEs系统引入绵羊1细胞期胚胎,定向精准修饰滩羊基因组,并借助胚胎移植技术,获得携带FecB基因特定点突变的滩羊个体。本试验过程及获得的主要结果如下:(1)多版本ABEs编辑效果细胞水平的验证与筛选本试验在FecB基因目标位点设计了1条sg RNA,利用脂质体转染技术,将多版本ABEs应用于绵羊细胞水平基因编辑,利用Sanger测序、T-A克隆及深度靶向测序检验编辑效率,确定基因编辑类型;利用Cas-OFFinder软件预测ABEs在全基因组范围的脱靶位点并进行检测,对其多方面进行综合评估,进而筛选出最优ABEs版本。试验结果表明,ABE7.10、ABEmax和x Cas9-ABE在绵羊FecB基因上的编辑效率分别为18.75%、53.85%及38.46%。与其他2个碱基编辑器相比,ABEmax的编辑效率最高,且未发生脱靶现象。因此,可以将ABEmax用于绵羊个体基因编辑。(2)ABEmax编辑效果胚胎水平的验证与评价利用体外转录及显微注射技术,将ABEmax m RNA和FecB-sg RNA导入滩羊1细胞期胚胎中,经体外培养获得基因编辑阳性胚胎。利用Sanger测序及T-A克隆检测编辑效率,确定基因编辑类型;利用Cas-OFFinder软件预测ABEmax在全基因组范围的脱靶位点并进行检测。试验结果表明,体外培养共获得48枚胚胎,其中共产生了10枚携带预期突变的胚胎,另有1枚胚胎产生了bystander编辑。T-A克隆检测显示,ABEmax在滩羊胚胎上具有较好的编辑能力(效率为22.91%)。Cas-OFFinder共预测了5个脱靶位点(OT1-OT5)。对11枚胚胎预测脱靶位点的PCR产物进行了测序,结果表明没有发生脱靶现象。试验证明,ABEmax在绵羊胚胎上具有引入点突变的良好效果,且在全基因组范围内未引起脱靶效应。(3)FecB基因突变滩羊的制备利用同期发情及超数排卵技术,从10只供体母羊中获得了96枚1细胞期胚胎,经显微注射ABEmax m RNA和sg RNA,将发育良好的胚胎移植到18个受体母羊中,获得6只妊娠母羊,最终获得8只基因编辑羔羊。经T-A克隆检测,这8只基因编辑羔羊均成功引入了点突变,其中6只羔羊是在p.Q249R位点上产生了预期的碱基替换(75%),2只羔羊仅发生了非预期的点突变(25%)。深度测序表明,ABEmax在目标位点最高编辑效率达到了48.5%。脱靶检测表明在预测的5个脱靶位点上均未发生碱基突变。说明ABEmax在绵羊个体水平上基因打靶精度较高,且未发生脱靶现象。综上,本研究利用ABEs在滩羊个体上成功产生了预期的FecB突变。利用Sanger测序、T-A克隆及深度靶向测序检测编辑效率,确定了基因编辑类型;利用Cas-OFFinder软件预测了ABE在全基因组范围内可能的脱靶位点,并进行了相应检测和综合评估。首次证明ABE系统应用于绵羊基因编辑分子育种是可行的、安全的。