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在复杂的环境中植物需要在其整个生命周期中应对大量刺激，在这个过程中Ca2+是一种普遍存在的第二信使，在许多种细胞代谢过程中发挥作用从而响应植物的生物和非生物胁迫反应。类钙调神经磷酸酶B(CBL)蛋白作为钙感受器，能够感知逆境Ca2+信号并与Ca2+结合，进而激活其下游蛋白激酶CIPK，通过与CBL互作蛋白激酶(CIPKs)相互作用，在植物对各种非生物胁迫的响应和生长发育中发挥重要作用。在转录调控过程中，基因启动子及其顺式作用元件可以激活或抑制基因的表达。因此分析在转录水平上调节基因表达的启动子功能，对揭示基因在植物生长发育与逆境防御中的调控机制至关重要，并可以为植物的抗逆性品种改良提供依据。本研究从大豆中克隆GmCBL7基因启动子(CblP7-1)全长序列及其4个不同长度的5端缺失片段。分别构建植物表达载体后稳定转化烟草和瞬时转化大豆毛状根，为GmCBL7基因启动子功能验证提供依据。本研究的主要研究结果如下：
1.根据植物基因组数据库Phytozome中大豆GmCBL7基因上游序列设计引物，从大豆中克隆得到GmCBL7基因启动子序列，序列长度为1523bp，命名为CblP7-1。通过启动子在线分析软件PLACE和PlantCARE预测后发现在该序列中存在许多启动子核心元件，如与转录起始有关的TATA-box和与转录频率有关的CAAT-box。还存在一些与逆境胁迫和植物激素诱导相关的调控元件：HSE(高温响应元件)，MBS(干旱响应元件，结合MYB转录因子)，MYB(参与干旱、盐和ABA应答)，MYC(干旱和ABA响应元件)，ABRE(ABA应答相关元件)，ERE(乙烯应答相关元件)等，以及一些与光调控、胚乳形成相关、分生组织表达和损伤响应相关的顺式作用元件。预测结果表明GmCBL7基因启动子在逆境胁迫下可被诱导表达。同时构建了该启动子驱动的植物双元表达载体pCAMBIA1301-CblP7-1。
2.通过农杆菌介导的叶盘法将启动子植物表达载体pCAMBIA1301-CblP7-1稳定转化烟草，获得2株CblP7-1融合gus报告基因的阳性转化植株。对转基因植株的根、茎、叶中的GUS活性分析结果表明，GmCBL7基因启动子在转基因植株中表现出不同的组织表达模式，特别是在茎中表达活性最强。GUS酶活测定结果表明，GmCBL7基因启动子参与调控大豆对高盐和干旱胁迫的应答。
3.为了进一步研究GmCBL7基因启动子的核心调控区域，对该启动子进行5’端缺失分析，克隆了4个5’端缺失片段，序列长度分别为1202bp(CblP7-2)，902bp(CblP7-3)，454bp(CblP7-4)和251bp(CblP7-5)，并分别构建了5’端缺失片段驱动的植物双元表达载体，分别为pCAMBIA1301-CblP7-2、pCAMBIA1301-CblP7-3、pCAMBIA1301-CblP7-4和pCAMBIA1301-CblP7-5。
4.利用农杆菌介导法将5种启动子植物表达载体分别对烟草和大豆毛状根进行瞬时转化，经过GUS组织化学染色后发现，全长片段CblP7-1(1523bp)和2个5’缺失片段CblP7-2(1202bp)，CblP7-3(902bp)具有启动活性，且CblP7-3启动活性最强；而CblP7-4(454bp)启动活性很弱，CblP7-5(251bp)无启动活性。推测该启动子核心调控区可能位于-1202~-454bp区域内。
1.根据植物基因组数据库Phytozome中大豆GmCBL7基因上游序列设计引物，从大豆中克隆得到GmCBL7基因启动子序列，序列长度为1523bp，命名为CblP7-1。通过启动子在线分析软件PLACE和PlantCARE预测后发现在该序列中存在许多启动子核心元件，如与转录起始有关的TATA-box和与转录频率有关的CAAT-box。还存在一些与逆境胁迫和植物激素诱导相关的调控元件：HSE(高温响应元件)，MBS(干旱响应元件，结合MYB转录因子)，MYB(参与干旱、盐和ABA应答)，MYC(干旱和ABA响应元件)，ABRE(ABA应答相关元件)，ERE(乙烯应答相关元件)等，以及一些与光调控、胚乳形成相关、分生组织表达和损伤响应相关的顺式作用元件。预测结果表明GmCBL7基因启动子在逆境胁迫下可被诱导表达。同时构建了该启动子驱动的植物双元表达载体pCAMBIA1301-CblP7-1。
2.通过农杆菌介导的叶盘法将启动子植物表达载体pCAMBIA1301-CblP7-1稳定转化烟草，获得2株CblP7-1融合gus报告基因的阳性转化植株。对转基因植株的根、茎、叶中的GUS活性分析结果表明，GmCBL7基因启动子在转基因植株中表现出不同的组织表达模式，特别是在茎中表达活性最强。GUS酶活测定结果表明，GmCBL7基因启动子参与调控大豆对高盐和干旱胁迫的应答。
3.为了进一步研究GmCBL7基因启动子的核心调控区域，对该启动子进行5’端缺失分析，克隆了4个5’端缺失片段，序列长度分别为1202bp(CblP7-2)，902bp(CblP7-3)，454bp(CblP7-4)和251bp(CblP7-5)，并分别构建了5’端缺失片段驱动的植物双元表达载体，分别为pCAMBIA1301-CblP7-2、pCAMBIA1301-CblP7-3、pCAMBIA1301-CblP7-4和pCAMBIA1301-CblP7-5。
4.利用农杆菌介导法将5种启动子植物表达载体分别对烟草和大豆毛状根进行瞬时转化，经过GUS组织化学染色后发现，全长片段CblP7-1(1523bp)和2个5’缺失片段CblP7-2(1202bp)，CblP7-3(902bp)具有启动活性，且CblP7-3启动活性最强；而CblP7-4(454bp)启动活性很弱，CblP7-5(251bp)无启动活性。推测该启动子核心调控区可能位于-1202~-454bp区域内。