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目的:肾纤维化是各种病因引起的慢性肾病（chronic kidney disease,CKD）进展为终末期肾脏疾病的共同病理表现,目前尚缺乏有效的防治手段。在肾纤维化发生发展过程中,多种肾实质细胞转分化形成大量的肌成纤维细胞,导致细胞外基质（extracelular matrix,ECM）过量沉积在肾小球及肾小管与血管之间的管周间质区域,在此期间伴随着多种免疫细胞浸润以及免疫因子的释放,促进了肾纤维化的进程。YAP（Yes associated protein）作为转录共激活因子,已经被证实调节肌成纤维细胞的活化,参与肾纤维化的进展。研究表明,抑制YAP的功能可有效延缓肾纤维化的进展,然而YAP的上游调节因子仍不明确。尽管有研究提出m6A调控因子在非小细胞肺癌中通过调节YAP的表达从而影响肿瘤的生长和转移,但是m6A能否通过调节YAP参与肾纤维化的发展仍不清楚。在众多m6A调节因子中,YTH结构域家族（YTH domain family,YTHDF）作为m6A的阅读蛋白,已被报道能识别并结合被m6A修饰的mRNA,从而调节mRNA的剪切、翻译及稳定性等。本研究的生物信息学分析结果表明,YTHDF1在人肾纤维化中呈显著高表达,且与YAP的表达呈正相关。因此,本研究拟通过体内外基因敲减和过表达实验来验证生物信息学的结果,即:YTHDF1通过调节YAP参与肾纤维化的进展。研究方法:1、本研究首先结合R软件和Perl编程语言分析GEO数据库中的基因芯片数据,将m6A调控因子在人正常对照和纤维化肾脏样本中的表达可视化,并筛选出差异表达的m6A调控因子,即YTHDF1。2、通过基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）预测纤维化肾脏中YTHDF1与YAP之间的相关性。3、随后,我们收集了正常对照组及慢性肾病患者的肾组织样本,采用免疫组化及免疫荧光双标染色检测YTHDF1与YAP在健康和纤维化的人肾组织中的表达及定位。4、为了进一步研究YTHDF1在肾纤维化中的角色及对YAP的调节作用,本研究构建了单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction,UUO）、高剂量叶酸（folic acid,FA）和单侧缺血再灌注损伤（unilateral ischemic reperfusion injury,U-IRI）诱导的小鼠肾纤维化模型。5、结合HE、Masson和PAS染色,以及免疫组织化学染色检测三种肾纤维化模型小鼠在损伤不同时期肾组织的病理和功能改变。6、基于生信分析结果以及在慢性肾病患者样本中筛选出的YTHDF1,本研究对三种小鼠肾纤维化模型的肾组织样本采用免疫组织化学染色、实时荧光定量、免疫蛋白印迹等手段检测YTHDF1的定位及表达,并通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测UUO模型小鼠肾组织的总体m6A水平。7、体外实验中,构建肾纤维化细胞模型,并通过转染小干扰RNA（small interfering RNA,si RNA）沉默筛选出的YTHDF1,检测沉默YTHDF1前后肌成纤维细胞的标志物（α-smooth muscle actin,α-SMA）,细胞外基质相关蛋白（fibronectin）,以及YAP的表达。8、体内基因敲减实验,UUO小鼠通过尾静脉注射胆固醇共轭-si RNA方法,抑制YTHDF1的表达,随后采用免疫组化染色、实时荧光定量、蛋白免疫印迹的方法,检测敲减YTHDF1前后UUO小鼠肾脏中YAP在mRNA和蛋白水平的定位及表达。同时,采用HE、Masson染色、免疫组化染色和蛋白免疫印迹的方法,以及血清生化分析,观察敲减YTHDF1前后UUO诱导的模型小鼠肾组织的病理和功能改变,以及α-SMA与细胞外基质相关蛋白（collagen I和fibronectin）的表达。9、通过RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）实验检测YTHDF1与YAP mRNA结合。10、体外基因过表达实验,检测过表达YTHDF1对α-SMA,fibronectin,及YAP的影响,并在过表达YTHDF1的同时敲减YAP,检测纤维化相关蛋白（α-SMA和fibronectin）的表达。结果:1、生信分析结果显示,YTHDF1（m6A识别蛋白）在人纤维化肾中显著的高表达。GSEA结果提示在人纤维化肾脏中YTHDF1与YAP的表达上调相关,并且相关性分析显示YTHDF1与YAP的表达呈强正相关。2、免疫组化显示YTHDF1与YAP在人纤维化肾组织中高表达,免疫荧光染色显示YTHDF1与YAP在慢性肾病患者的纤维化肾组织的间质、肾小球和部分小管表达呈共定位。3、肾小管转运功能检测显示,在FA和UUO诱导的小鼠肾纤维化模型中,近端小管的损伤早于集合管,水通道蛋白（aquaporin,AQP）-1和-2在急性损伤期的小管细胞上表达增强,然而模型后期（14d及以后）损伤严重的小管（壁菲薄,腔扩张,细胞脱落）不再表达AQP-1和AQP-2。4、ELISA显示UUO模型组（UUO14d）小鼠肾脏的总体m6A水平较正常对照组显著增高。5、在UUO、FA及U-IRI三种小鼠模型中,肾损伤诱导的第14天,大量α-SMA阳性的肌成纤维细胞在管周间质区域形成,伴随胶原纤维的显著沉积。与此同时,YTHDF1在三种模型组的肾组织样本呈现显著的高表达,且与α-SMA,collagen I和fibronectin的表达呈显著正相关。6、在肾纤维化的细胞模型中,沉默YTHDF1显著抑制α-SMA,fibronectin,以及YAP的表达。7、在UUO小鼠模型中,敲减YTHDF1显著抑制YAP及其下游结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的表达。此外,敲减YTHDF1显著降低小鼠肾脏肌成纤维细胞的生物标志物（α-SMA）和ECM成分（collagen I和fibronectin）的表达。同时,减轻了UUO小鼠肾脏的病理损伤,降低了模型组小鼠的血清肌酐和尿素氮水平。8、RIP实验显示YTHDF1与YAP mRNA结合。9、体外过表达YTHDF1促进α-SMA,fibronectin,以及YAP的表达,然而在过表达YTHDF1同时敲减YAP,可显著抑制α-SMA和fibronectin的表达。结论:本研究表明,YTHDF1与YAP在人和小鼠肾纤维化组织中显著高表达且呈正相关。敲减YTHDF1显著抑制YAP表达的同时改善了UUO诱导的肾纤维化模型鼠肾的病理及功能。体外过表达及RIP实验提示YTHDF1与YAP mRNA结合,从而上调YAP的表达,促进肾纤维化的进展,从而为肾纤维化的靶向治疗提供实验依据。