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目的食管癌是消化系统最具侵略性的恶性肿瘤之一,其特点是死亡率高,预后差。我国是食管癌的高发地区,食管鳞状细胞癌(ESCC)是我国食管癌发生的主要组织学亚型。由于早期症状不明显,临床上大多数患者往往一经诊断即为晚期,因此错过了手术机会,而以放化疗的治疗方式为主。因此,患者对化疗药物的应答尤为重要。EphA2是Eph受体超家族的成员,被发现在多种癌症中过表达,包括前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肺癌、食管癌等,是研究较为广泛的一个抗癌药物开发靶点。针对酪氨酸激酶的靶向药物达沙替尼和恩沙替尼对其也有着抑制作用。但近年来,随着研究的开展,发现EphA2在癌症中的作用缺乏一致性。有证据表明EphA2促进了上皮间质转化,敲低EphA2后抑制了癌症的转移和血管生成,也有文献报道EphA2能抑制致癌的Akt-mTORC1和RAS-ERK信号传导,敲低EphA2后表现出促进了癌细胞的生长、迁移和侵袭。这证明EphA2在癌症中具有双重作用,因此影响了相关靶向药物在临床的应用和疗效的判定。2001年,发现EphA2是p53家族(p53,p63和p73)的靶基因,确定了位于EphA2启动子中的p53反应元件。该元件可响应野生型p53,诱导细胞凋亡,但该元件不响应突变型p53。同时,野生型p53还可上调EphA2的配体ephrin-A1的表达。近年来,越来越多的证据表明,EphA2通过依赖于配体的激活抑制了癌症的进展,不依赖配体的激活促进了癌症的进展。这都说明p53在EphA2对肿瘤进展影响中起关键作用。p53是最重要的肿瘤抑制因子之一,参与多种与癌症相关的途径的调控,同时p53也是癌症中最常见的突变基因,p53的突变通常与癌症的不良预后有关。已有报道在食管鳞癌中存在p53突变,但EphA2在食管鳞癌中的作用是否和p53状态有关目前尚未有研究。因此本研究拟以本地高发的、具有明显地域特色的ESCC为研究对象,通过基因沉默技术、Western blot和细胞生物学功能学研究分别研究p53野生型和p53突变型食管鳞癌细胞中EphA2的作用,探讨EphA2在食管鳞癌中是否具有双重作用且是否与p53状态有关,为精准医学理念下对所患肿瘤进行更为准确的分类,帮助患者选择更有针对性的治疗方案,提高靶向药物疗效提供新的方向和希望。方法1.取两张相同的食管鳞癌组织芯片,分别检测EphA2和p53在食管鳞癌组织中的表达情况。2.Western blot检测食管鳞癌细胞 KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE450、KYSE510、Eca109中EphA2和p53的表达情况,选择p53状态不同,EphA2表达量相对较高的细胞来进行后续实验。3.在p53野生型食管鳞癌细胞中敲低EphA2,观察对细胞增殖、迁移、侵袭、EMT的影响。(1)建立p53野生型食管鳞癌敲低EphA2的稳定细胞株。分别使用三个不同的shEphA2慢病毒感染p53野生型食管鳞癌细胞中高表达EphA2的KYSE30、Eca109细胞,细胞扩增后分别进行流式分选,并且用荧光显微镜观察细胞的绿色荧光确定慢病毒的转染效率和流式分选效率,然后通过Western blot分别鉴定建立的KYSE30、Eca109细胞稳株中EphA2的敲低效率,筛选出KYSE30、Eca109细胞中EphA2敲低效果最明显的细胞稳株,进行后续实验。(2)用CCK-8法检测敲低EphA2的KYSE30和Eca109细胞在(0h、24h、48h、72h、96h)的增殖能力。(3)通过细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测在KYSE30和Eca109细胞中敲低EphA2对细胞迁移能力的影响。(4)通过transwell侵袭实验检测敲低EphA2后,对KYSE30和Eca109细胞侵袭能力的影响。(5)用Western blot分别检测敲低EphA2后,KYSE30、Eca109细胞中上皮标志物E-cadherin和Claudin-1的变化情况,间质标志物N-cadherin、Vimentin和Snail的变化情况,判断敲低EphA2后对KYSE30、Eca109细胞EMT进程的影响。4.在p53突变型食管鳞癌细胞中敲低EphA2,观察对细胞增殖、迁移、侵袭、EMT的影响。(1)建立p53突变型食管鳞癌敲低EphA2的细胞株。分别使用两个不同的siRNA序列瞬时转染p53突变型食管鳞癌细胞中高表达EphA2的KYSE150细胞,瞬时转染72h后时,用Western blot检测KYSE150细胞中EphA2的敲低效率,并选出敲低效果最明显的siEphA2序列,进行后续实验。(2)通过CCK-8法检测敲低EphA2后,KYSE150细胞在(0h、24h、48h、72h、96h)的增殖能力。(3)通过细胞划痕实验和Transwell迁移实验检测敲低EphA2后,对KYSE150细胞迁移能力的影响。(4)通过Transwell侵袭实验检测敲低EphA2后,对KYSE150细胞侵袭能力的影响。(5)使用Western blot检测KYSE150细胞敲低EphA2后,上皮标志物E-cadherin和Claudin-1的变化情况,间质标志物Vimentin和Snail的变化情况,判断敲低EphA2后对KYSE150细胞EMT进程的影响。结果1.在食管鳞癌组织中,存在EphA2高表达p53突变的情况和EphA2高表达p53野生的情况。2.在不同的食管癌细胞中,TP53的状态不同,p53和EphA2的表达也不同。(1)Western blot 实验结果显示 p53 在 KYSE30、KYSE510、Eca109 中低表达,在 KYSE150、KYSE410、KYSE450 中高表达。(2)在p53野生型食管鳞癌细胞中,KYSE30和Eca109细胞的EphA2表达量相对较高,在p53突变型食管鳞癌细胞中,KYSE150细胞的EphA2表达量相对较高;选择KYSE30、Eca109、KYSE150细胞来进行后续实验。3.在p53野生型食管鳞癌细胞中,敲低EphA2对细胞增殖、迁移、侵袭、EMT的影响。(1)CCK-8实验结果表明,敲低EphA2明显促进了 KYSE30、Eca109细胞的增殖能力。(2)细胞划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,敲低EphA2促进了KYSE30、Eca109细胞的迁移能力。(3)Transwell侵袭实验结果显示,敲低EphA2促进了 KYSE30、Eca109细胞的侵袭能力。(4)Western blot结果显示,敲低EphA2后KYSE30上皮标志物E-cadherin表达降低,Eca109细胞上皮标志物E-cadherin表达升高,但KYSE30和Eca109细胞的上皮标志物Claudin-1表达均降低,间质标志物N-cadherin、Vimentin和Snail表达均升高,说明敲低EphA2后促进了KYSE30、Eca109 细胞的 EMT 进程。4.在p53突变型食管鳞癌细胞中,敲低EphA2对细胞增殖、迁移、侵袭、EMT的影响。(1)CCK-8实验结果表明,敲低EphA2明显抑制了 KYSE150细胞的增殖能力。(2)细胞划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,敲低EphA2抑制了KYSE150细胞的迁移能力。(3)Transwell侵袭实验结果显示,敲低EphA2抑制了 KYSE150细胞的侵袭能力。(4)Western blot结果显示,敲低EphA2后KYSE150细胞的上皮标志物E-cadherin和Claudin-1表达增高,间质标志物Vimentin和Snail表达降低,说明敲低EphA2后抑制了 KYSE150细胞的EMT进程。结论1.p53野生型食管鳞癌细胞中EphA2高表达抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭;p53突变型食管鳞癌细胞中EphA2高表达促进了细胞的增殖、迁移和侵袭。2.p53野生型食管鳞癌细胞中EphA2高表达抑制了细胞的EMT进程;p53突变型食管鳞癌细胞中EphA2高表达促进了细胞的EMT进程。3.EphA2在食管鳞癌细胞中具有双重作用,且不同作用与p53不同状态有关。