1研究目的脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是一种发生于中枢神经系统的严重的创伤性疾病,致残率高,而且发病率逐年上升,给患者、家庭及社会带来了沉重的负担。督脉电针治疗在SCI后神经功能的修复方面有很好的临床疗效,但其机制尚未完全阐明。SCI后神经功能的修复机制主要集中在补充替代凋亡的神经细胞、促进神经轴突的再生及再髓鞘化、改善损伤局部的微环境三个方面。依据本课题组的前期研究发现,督脉电针可以抑制神经细胞凋亡、促进神经细胞修复再生,有效促进SCI后神经功能的恢复。本研究以督脉电针为干预手段,系统观察督脉电针对SCI后损伤部位神经干细胞、神经元细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞的影响情况,以与神经干细胞增殖分化紧密相关而又相互影响的Wnt、Notch信号通路为切入点,深入探讨督脉电针是否可以通过调节Wnt、Notch信号通路实现对SCI后内源性神经干细胞增殖分化的调节,进而促进SCI后神经功能的修复,为SCI的临床治疗提供科学的实验依据。2研究方法本研究为动物实验研究,采用改良式Allen’s打击法复制SCI动物模型。分1d、7d、14d、28d四批次进行,选用SD大鼠,随机分为空白对照组(B组)、空白+电针对照组(BE组)、模型对照组(M组)、假手术组(S组)、电针治疗组(EA组)。EA组选取“大椎”、“命门”二穴进行电针干预,20min/d,治疗至相应天数；BE组,干预方法同EA组；B组、S组、M组,在EA组电针干预的同时,给予相同时间、相同强度的抓取、固定,以保证相同的应激条件,但不进行电针治疗。在28d批次大鼠干预1d、7d、14d、28d后,分别进行体质量监测并采用BBB评分进行神经功能评分,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠体质量变化及神经功能恢复情况的影响；在各批次大鼠完成相应干预天数之后,采用HE染色方法观察各组大鼠受损脊髓局部病理改变,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠受损脊髓局部病理改变的影响；采用免疫组织化学法检测各组大鼠受损脊髓局部Nestin、NSE、APC、GFAP的表达情况,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠受损脊髓局部内源性神经干细胞增殖及分化的影响；采用免疫组织化学方法和Western Blot方法检测各组大鼠受损脊髓局部Wnt1、Wnt3a、β-catenin表达情况,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠受损脊髓局部Wnt信号通路的影响；采用免疫组织化学方法和Western Blot方法检测各组大鼠受损脊髓局部Delta1、 Presenilin1、Hes1、Hes5表达情况,比较不同时间点督脉电针对各组大鼠受损脊髓局部Notch信号通路的影响。3研究结果3.1体质量变化结果显示,Day1、Day 7、Day 14、Day28时,与同时间点B组相比,BE组、S组大鼠体质量均无显著性变化(Z>0.05); Day7、Day 14、Day28时,与同时间点B组相比,M组体质量都显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)；经过督脉电针干预,在Day 7、Day 14、Day28时,EA组大鼠的体质量都较同时间点M组大鼠有显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),整体观察,与B组相比,M组、EA组大鼠在SCI后体质量增长趋势都显著降低,而经督脉电针干预后,EA组增长趋势较M组显著提高。3.2 BBB评分结果显示,BE组、S组大鼠BBB评分在Day1、Day7、Day14、 Day 28都同同时间点B组大鼠一样,功能评分都为满分(21分)；M组大鼠的BBB评分在Day1、Day7、Day14、Day28都较同时间点B组大鼠有显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),而EA组大鼠的BBB评分在Day7、Day 14、Day28都较同时间点M组大鼠显著提高,差异有统计学意义(P<0.01),整体观察,M组、EA组大鼠的BBB评分随着时间的变化都有总体升高趋势,EA组大鼠BBB评分的增长趋势要显著高于M组大鼠。3.3不同时间点各组大鼠脊髓组织受损局部HE染色结果显示,1d、7d、14d、 28d,B组、BE组、S组均可看到脊髓组织中灰质与白质结构完整、分界清晰,前角神经元细胞完整,胞体内可见大而圆的胞核,核仁清晰,尼氏小体丰富,聚集于细胞核周围；SCI后1d,M组的灰质中可见大面积的红细胞渗出,神经元细胞结构被破坏,细胞核模糊不清,伴有有轻度水肿,且数目减少,7d时,灰白质界限消失,损伤中心出现液化性坏死、空洞,可见大量的巨噬细胞、泡沫细胞、胶质细胞,神经元细胞基本消失,14d时,M组灰白质界限隐约可见,有少量神经元细胞,但神经元细胞水肿明显,且有空泡形成,28d时,灰白质界限较为清楚,仍有大量泡沫细胞及炎细胞浸润,神经元细胞水肿明显,且有胶质瘢痕形成；而督脉电针可明显减少神经元细胞的凋亡,减少炎症浸润,抑制胶质瘢痕的形成,促进脊髓组织的修复。3.4不同时间点各组大鼠脊髓组织受损局部内源性神经干细胞增殖分化结果显示,Id、7d、14d、28d,与同时间点B组相比,BE组、S组大鼠脊髓组织中Nestin、 NSE、APC、GFAP表达都无显著差异；1d、7d、14d、28d,与同时间点B组相比,M组大鼠脊髓组织受损局部Nestin表达都显著升高(P<0.01)、NSE、APC表达都显著降低(P<0.01),在1d、7d、14d时,M组GFAP的表达均较同时间点B组显著升高(P<0.01或P<0.05)；1d、7d、14d、28d,与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部Nestin、NSE表达都显著升高(P<0.01)；与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部APC表达都有升高,但是仅在28d时有显著性差异(P<0.05); 1d、7d、14d时,与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部GFAP表达都显著降低(P<0.01或P<0.05)。3.5不同时间点各组大鼠脊髓组织受损局部Wnt信号通路相关因子表达结果显示,1d、7d、14d、28d,与同时间点B组相比,BE组、S组大鼠脊髓组织中Wntl. Wnt3a、β-catenin表达都无显著差异；与同时间点B组相比,M组大鼠脊髓组织受损局部Wnt1、Wnt3a、β-catenin表达都显著升高(P<0.01或P<0.05)；与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部Wnt1、Wnt3a、β-catenin表达都显著升高(P<0.01或P<0.05)。3.6不同时间点各组大鼠脊髓组织受损局部Notch信号通路相关因子表达结果显示,1d.7d.14d.28d,与同时间点B组相比,BE组、S组大鼠脊髓组织中Deltal. Presenilinl、Hes1、Hes5表达都无显著差异；与同时间点B组相比,M组大鼠脊髓组织受损局部Delta1、Presenilin1、Hes1、Hcs5表达都显著升高(P<0.01或P<0.05)；与同时间点M组相比,EA组大鼠脊髓组织受损局部Delta1、Presenilin1、HCS1、 Hes5表达都显著降低(P<0.01或P<0.05)。4结论4.1 SCI可以引起大鼠体质量降低、神经功能缺损,而督脉电针可以促进SCI后大鼠体质量及神经功能恢复。4.2督脉电针可明显减少SCI后大鼠损伤局部神经元细胞的凋亡及炎症浸润,抑制胶质瘢痕形成,并促进脊髓组织的修复4.3督脉电针可以促进SCI后大鼠损伤局部内源性神经干细胞的激活和增殖,并促进内源性神经干细胞向神经元细胞和少突胶质细胞分化,同时抑制内源性神经干细胞过度分化为星形胶质细胞；4.4督脉电针可以增加SCI后大鼠损伤局部Wnt1、Wnt3a的表达,进而抑制胞质内β-catenin的磷酸化和泛素化,促进β-catenin的大量积累,从而促进Wnt信号通路的上调,这可能是督脉电针促进SCI后大鼠损伤局部内源性神经干细胞增殖,同时促进内源性神经干细胞向神经元细胞分化的机制之一；4.5督脉电针可以抑制SCI后大鼠损伤局部Notch信号通路配体Delta1的表达,进而抑制细胞内Presenilin1的表达,从而抑制Notch信号通路的过度激活,减少其下游基因Hes1、Hes5的表达,这可能是督脉电针促进SCI后大鼠损伤局部内源性神经干细胞向神经元细胞、少突胶质细胞分化,同时抑制内源性神经干细胞过度分化为星形胶质细胞分化的机制之一。