睡眠呼吸障碍疾病是一组发生在睡眠状态下的呼吸异常疾病,包括阻塞性睡眠呼吸暂停、中枢性睡眠呼吸暂停和睡眠相关性肺泡低通气等。其中,先天性中枢性低通气综合征（congenital central hypoventilation syndrome,CCHS）是一种罕见的遗传性睡眠呼吸障碍综合征,其主要特征是新生儿在入睡后出现严重的肺泡低通气,需要借助呼吸机维持通气。机体发生肺泡低通气时,对高碳酸和低氧的敏感性降低甚至丧失,最终造成呼吸衰竭。基因测序结果显示,90%以上的CCHS病人有paired-like homeobox 2b（Phox2b）基因突变。Phox2b基因位于第4对常染色体上,其编码的蛋白质主要参与胚胎期自主神经系统的发育。Phox2b表达在呼吸反射的传入通路上,包括颈动脉体（carotid body,CB）、孤束核（nucleus tractus solitarii,NTS）、斜方体后核（retrotrapezoid nucleus,RTN）和蓝斑核（locus coeruleus）等。中枢呼吸化学感受器反射通过感受细胞外液中CO₂/H⁺变化,调节肺通气反应和排出CO₂,维持机体内环境酸碱平衡,因此是一种重要的稳态调节机制。作为中枢呼吸化学感受器,最少需要满足以下几个特征或标准:（1）对生理范围内CO₂/H⁺的变化具有内在敏感性;（2）整体水平条件下,CO₂刺激引起适应性通气反应;（3）与呼吸节律中枢有结构或功能上的联系,选择性的激活、抑制或者损毁此细胞群能易化或者抑制呼吸。中枢呼吸化学感受器可为呼吸节律中枢和中枢模式发生器提供兴奋性驱动,使机体作出适应性通气反应。当这类细胞功能异常时,会减弱中枢性呼吸驱动,导致低通气或呼吸暂停。研究发现,选择性激活表达Phox2b的RTN神经元增强中枢性呼吸驱动;损毁Phox2b神经元抑制呼吸化学感受器反射,而且,TASK-2通道和G-protein coupled receptor 4（GPR4）介导了RTN神经元的p H敏感性反应。因此,RTN的Phox2b神经元是重要的中枢呼吸化学感受器。早期研究发现,NTS神经元参与高碳酸性通气反应,并且一部分神经元具有pH敏感性,但NTS神经元作为中枢呼吸化学感受器的生物化学表型有待明确,以及NTS神经元的pH敏感性的分子底物尚未揭示。综上分析,本研究旨在研究NTS的Phox2b神经元是否参与呼吸调控及其可能的分子神经机制。我们将观察:（1）选择性刺激Phox2b神经元对小鼠呼吸功能的影响;（2）损毁Phox2b神经元对中枢呼吸化学感受器反射（高碳酸性通气反应）的影响;（3）GPR4是否介导了NTS的中枢呼吸化学感受器反射。第一部分:选择性刺激孤束核Phox2b神经元增强呼吸功能目的:观察激活孤束核Phox2b神经元对小鼠呼吸功能的影响方法:实验选用Phox2b-Cre成年雄性小鼠。在NTS分别注射cre重组酶诱导的病毒载体AAV-EF1α-DIO-mCherry（对照病毒）、AAV-EF1α-DIO-hM3Dq-mCherry（化学遗传学）和AAV-EF1α-DIO-Ch R2-mCherry（光遗传学）。应用化学遗传学方法观察慢性激活Phox2b神经元对动物肺通气功能的影响;利用光遗传学方法观察激活Phox2b神经元对麻醉小鼠膈神经放电的影响;应用全身无创体积描记系统（WBP）测定小鼠的呼吸参数,包括潮气量（TV）、呼吸频率和每分通气量（MV）;应用无线生理信号遥测系统记录动物的收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均动脉压（MAP）和心率（HR）。结果:1.免疫荧光结果显示,Phox2b⁺mCherry⁺神经元约占mCherry⁺神经元总数的83%,占Phox2b⁺神经元总数的13%。脑片膜片钳记录显示,Clozapine N-oxide（CNO）可快速去极化表达hM3Dq-mCherry的神经元。结果提示,CNO能特异性激活绝大多数孤束核Phox2b神经元。2.CNO刺激Phox2b神经元可长时间增加动物呼吸频率及MV,持续至少90分钟,整个过程TV没有明显变化。3.CNO刺激Phox2b神经元降低SBP、DBP和MAP,持续至少30分钟;在激活Phox2b神经元30分钟左右时可短暂增加HR。因此,刺激Phox2b神经元可产生压力感受器反射样作用。4.联合应用CNO和5%CO₂显著增加小鼠的呼吸频率和MV,比单独应用CNO或5%CO₂产生的效果更明显,因此,激活Phox2b神经元能够增强中枢呼吸化学感受器反射。5.在麻醉、双侧迷走神经切断、呼吸机维持的小鼠出现膈神经放电停止时（呼气末二氧化碳浓度ETCO₂≤1%）,激光刺激（473 nm）Phox2b神经元可快速再次诱发出膈神经放电;还可在ETCO₂=3%时使呼吸频率显著增加。因此,光遗传学刺激Phox2b神经元可增强麻醉小鼠的中枢性呼吸驱动。6.免疫荧光结果显示,8%CO₂刺激产生的cFos⁺mCherry⁺神经元占mCherry⁺神经元总数的18%,约占cFos⁺神经元总数的12%。因此,Phox2b神经元的一个亚群具有CO₂敏感性。7.神经元示踪实验发现,Phox2b神经元的轴突直接投射到延髓腹外侧的呼吸中枢模式发生器,可能包括延髓腹侧呼吸组的头端区（rVRG）,前包钦格复合体（pre-B?tzinger complex）和包钦格复合体（B?tzinger complex）等。小结:化学遗传或光遗传性激活Phox2b神经元,增强中枢性呼吸驱动和肺通气反应;其解剖学基础是这类神经元可能直接与呼吸中枢模式发生器存在突触联系;其调控机制既涉及激活CO₂敏感性神经元和/或非CO₂敏感性神经元。第二部分:损毁孤束核Phox2b神经元减弱高碳酸性通气反应目的:观察慢性损毁孤束核Phox2b神经元对清醒小鼠高碳酸性通气反应的影响。方法:实验选用野生型ICR成年雄性小鼠。实验分为三组（NTS注射）:生理盐水组（对照）、Blank-saporin（对照）和substance P-saporin（SSP-SAP）组。注射substance P-saporin（SSP-SAP）以损毁Phox2b神经元。应用WBP记录清醒小鼠的呼吸参数,评估损毁Phox2b神经元对小鼠高碳酸性通气反应（中枢呼吸化学感受器反射）的影响。结果:1.当吸入0-8%CO₂时,有窦神经支配和切除窦神经的两组小鼠的TV、呼吸频率和MV均无显著性差异,提示高碳酸性通气反应主要激活中枢呼吸化学感受器。2.当SSP-SAP造成13%的Phox2b神经元破坏时,可使吸入8%CO₂条件下的TV和MV均减少13%;破坏18%的Phox2b神经元,可引起吸入4%CO₂条件下的TV减少22%,MV减少18%。两种条件下,各组之间呼吸频率无显著性差异。同时,破坏Phox2b神经元并不影响基础呼吸参数。3.免疫荧光结果显示,CO₂激活的神经元中有74%表达Phox2b,而Phox2b神经元中有10%为CO₂激活的神经元。小结:破坏NTS Phox2b神经元抑制中枢呼吸化学感受器反射,其原因可能由于CO₂敏感性Phox2b神经元数目显著减少所致。第三部分:孤束核GPR4信号参与高碳酸性通气反应目的:观察敲低小鼠NTS的GPR4对高碳酸性通气反应的影响方法:实验选用野生型ICR成年雄性小鼠,分为阴性对照组（Scramble-shRNA）和敲低组（GPR4-shRNA）。在NTS注射Ad-GPR4-shRNA-EGFP敲低小鼠GPR4,观察高碳酸性通气反应是否减弱;采用qPCR和Western Blot评估GPR4的敲低效率;免疫荧光染色后计算cFos阳性（CO₂激活）神经元的数量。结果:1.敲低组NTS的GPR4 mRNA水平含量降低约30%,蛋白含量降低约22%。2.吸入4-8%CO₂,敲低组小鼠的TV和MV显著降低,而呼吸频率与对照组无明显差异。结果表明,敲低NTS GPR4减弱高碳酸性通气反应。3.敲低组小鼠的CO₂激活的神经元明显少于对照组。4.敲低GPR4引起细胞内信号分子pSTAT3蛋白含量明显降低,（⁵6%）,提示pSTAT3可能是GPR4的信号途径中的重要成分。小结:GPR4作为NTS神经元的pH敏感性的分子感受器参与了高碳酸性通气反应。结论:孤束核Phox2b神经元的一个亚群具有化学敏感性,兴奋这类神经元可增强中枢性呼吸驱动和肺通气,损毁此类神经元抑制中枢呼吸化学感受器反射,而GPR4是孤束核参与中枢呼吸化学感受器反射重要的分子化学感受器。