猪的呼吸道粘膜是由不同类型的假复层上皮细胞构成的,他们分别有纤毛柱状上皮细胞,形似酒杯的具有分泌功能的高杯细胞和粘膜底层的基底细胞。这些细胞形成一道天然屏障,保护呼吸道和肺免受感染,构成机体防御的重要组成。为了研究呼吸道上皮细胞的复杂机理和不同功能,研究人员已经研制出人呼吸道上皮细胞分离培养模式,即气管原代黏膜上皮细胞气液界面培养模型。这种体外模型与气管黏膜上皮细胞在体内生长的形态类似,同时又排除了动物活体由于环境因素产生的不确定性,可以作为研究病毒及其他一些呼吸道病原体对猪气管感染机制的模型。然而,由于细胞在体内的生长环境是一个3D环境,通常在体外生长时不会分化为具有一定功能的形态。因此,使原代气管上皮细胞分化为具有一定功能的上皮细胞仍然是体外模型建立的难点。为了建立一个体外猪原代呼吸道上皮细胞气液界面培养模型,我们分别对供体猪的选择标准、原代细胞分离消化时间、培养基配方的种类等方面进行筛选确定。在供体猪健康状态方面发现,供体猪在感染猪肺炎支原体等呼吸道病原时会严重影响原代气管上皮细胞的活性与体外增殖能力;而大龄猪(3月龄)较小龄猪(0.5月龄)细胞总数多,它们活的纤毛细胞比例接近。因此,我们推荐使用2-3月龄,无猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒或猪肺炎支原体等呼吸道病原感染的健康仔猪作为合适的供体猪。2-3月龄猪的气管上皮细胞的最佳消化时间为24-30小时。对于培养基,优化BEGM培养基,即使其表皮生长因子浓度为10ng/ml,视黄酸的浓度为10-7M,然后从优化的BEGM,优化的BEGM/5%FCS,DMEM/F12/2%USG,DMEM/F12/5%FCS 四种培养基中筛选出优化的BEGM/5%FCS配方。利用该培养基培养猪原代呼吸道上皮细胞,发现,细胞接种至插入式细胞培养小室24小时后,细胞贴壁率高,细胞增殖速度最快。一般2-4天可以迅速铺满整个插入式培养小室的膜表面,形成气液界面培养;细胞生长6天后,扫描电镜可见大多数细胞表面覆盖有微绒毛,少数部分有纤毛分化;气液界面培养7天后,细胞结构呈现立体圆形,细胞电阻值达280Ω/cm2;14天后,扫描电镜观察可见有分化成熟的纤毛,细胞脱落并且细胞间空隙增大;但当细胞生长到21天时,大部分细胞开始脱落,存活的细胞可见生长成熟的纤毛。本研究成功建立了猪原代气管黏膜上皮细胞的气液培养模型。下一步的工作将着重于该模型在体外的持续期研究。