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猪对氮营养素的利用效率受诸多因素的影响，日粮蛋白水平是影响猪的生长发育和养分利用效率的关键因素。肝脏是哺乳动物重要的代谢器官，日粮蛋白水平在肝脏氨基酸代谢、分泌性蛋白质合成、尿素循环、糖脂代谢、排毒等生化过程中发挥着重要作用，其中尿素循环是体内氮排放的主要形式，但其分子调控机制还不清楚。因此本研究利用高通量测序手段比较分析了低蛋白日粮与正常蛋白日粮断奶仔猪肝脏相关蛋白质和miRNAs表达规律，并对差异表达的蛋白和miRNAs进行相互作用的网络分析，以寻找与调控尿循环素代谢相关的关键miRNAs，为低蛋白日粮调控肝脏尿素循环的分子机制提供理论依据。
试验一、试验选用18头28日龄断奶的杜×长×大三元杂交仔猪(初始体重：9.57±0.61kg)，随机分为3个处理组，处理组日粮的粗蛋白质(Crudeprotein，CP)水平分别为20%CP、17%CP和14%CP。饲养30d后采集血样和肝脏用于蛋白组学分析和后续相关指标检测。iTRAQ结果显示3个试验组肝脏中共获得6222个蛋白，17%CP与20%CP组相比共得到的差异蛋白172个；14%CP与20%CP组相比共得到差异蛋白235个。KEGG通路分析显示17%CP与20%CP组相比所得到的差异蛋白共富集到13条通路，14%CP与20%CP组富集的通路有15条，均主要是集中在与氨基酸代谢、糖脂代谢、维生素代谢、氧化应激、免疫、ECM等相关的代谢通路。结合iTRAQ分析、Western Blot验证及其它相关指标的检测结果发现，相比20%CP组，14%CP组显著抑制了肝脏蛋白质的生物合成，而17%CP促进了蛋白质的生物合成；低蛋白日粮（14%CP组和17%CP组）均显著抑制肝脏尿素合成，糖异生和脂肪氧化，促进了肝糖原和脂肪合成。
试验二、为分析低蛋白日粮与正常日粮组间差异miRNAs表达规律，并筛选出与尿素循环相关miRNAs，本试验采用Solexa深度测序技术分析不同蛋白日粮组猪肝脏miRNA表达谱。结果显示，共获得606条成熟体miRNAs，其中差异miRNAs为52个（包括30个上调，22个下调），且3个上调的miRNAs（ssc-miR-19b、ssc-miR-19a、hsa-miR-192-3p）在14%CP和17%CP组间表达趋势相反。经生物信息学分析发现共有15个miRNAs靶向尿素循环关键酶及其调控因子，提示这些miRNAs可能参与了调控尿素循环的过程。
试验三、通过生物信息学分析，本试验选择8个候选miRNAs并合成其相应模拟物mimics和inhibitor，转染至猪原代肝细胞，以观察其在细胞水平上尿素的合成变化。结果显示，靶向SIRT5的3个miRNAs(ssc-miR-19b、ssc-miR-145-5p、ssc-miR-204) mimics显著（P<0.05）抑制细胞外尿素含量和SIRT5/CPS1的蛋白表达；ssc-miR-19b和ssc-miR-204 inhibitor显著（P<0.05）促进尿素合成，但ssc-miR-145-5p inhibitor与mimics结果不一致。随后采用双荧光素酶报告系统验证此 miRNAs(ssc-miR-19b、ssc-miR-145-5p、ssc-miR-204)对SIRT53’-UTR的靶向作用，结果表明ssc-miR-19b能靶向SIRT5。同时，利用不同浓度氨基酸处理猪原代肝细胞，结果显示，高浓度氨基酸显著（P<0.05）增加尿素合成及SIRT5和CPS1蛋白表达量（P<0.05），采用miR-19b mimics干预后，降低了尿素含量和SIRT5和CPS1的蛋白表达量，该结果提示低蛋白日粮下，ssc-miR-19b可通过靶向SIRT5抑制其蛋白表达，进一步降低CPS1酶活从而减少尿素合成。
试验四、为验证ssc-miR-204是否通过靶向糖皮质激素受体（GR）调控尿素循环，首先通过荧光素酶双报告基因系统验证ssc-miR-204对预测靶基因GR3’-UTR的靶向作用，再以猪原代肝细胞为研究对象，采用体外合成ssc-miR-204mimic或inhibitor处理原代肝细胞（以NC或iNC为阴性对照），检测细胞内GR蛋白表达及细胞上清尿素含量等指标，用以确认 ssc-miR-204是否可通过靶向 GR3’-UTR调控尿素循环。结果显示ssc-miR-204可显著抑制荧光素酶活性（P<0.05），而缺失和突变载体的荧光素酶活性没有变化，表明ssc-miR-204与GR3’-UTR具有靶关系。转染猪原代肝细胞后发现ssc-miR-204 mimics显著降低CPS1和GR蛋白表达（P<0.05），而inhibitor却恢复了miR-204 mimics的作用。此外，通过不同浓度地塞米松处理肝细胞后采用miR-204mimics进行干预处理，结果进一步证明ssc-miR-204可通过靶向GR抑制尿素合成。同时，本试验采用不同浓度氨基酸处理肝细胞后，发现高浓度氨基酸显著增加尿素的合成、GR和CPS1的蛋白表达量（P<0.05），随后用miR-204 mimics干预后，降低了尿素含量及GR和CPS1的蛋白表达量，该结果进一步表明，低蛋白日粮情况下ssc-miR-204能通过靶向GR抑制尿素合成。
综上所述，本研究全面比较分析了低蛋白日粮与正常日粮对猪肝脏蛋白质和miRNA表达的差异，并验证了差异表达的ssc-miR-19b和ssc-miR-204可分别通过靶向SIRT5和GR抑制其相应蛋白的表达，进而下调CPS1基因表达，从而减少了尿素的合成。
试验一、试验选用18头28日龄断奶的杜×长×大三元杂交仔猪(初始体重：9.57±0.61kg)，随机分为3个处理组，处理组日粮的粗蛋白质(Crudeprotein，CP)水平分别为20%CP、17%CP和14%CP。饲养30d后采集血样和肝脏用于蛋白组学分析和后续相关指标检测。iTRAQ结果显示3个试验组肝脏中共获得6222个蛋白，17%CP与20%CP组相比共得到的差异蛋白172个；14%CP与20%CP组相比共得到差异蛋白235个。KEGG通路分析显示17%CP与20%CP组相比所得到的差异蛋白共富集到13条通路，14%CP与20%CP组富集的通路有15条，均主要是集中在与氨基酸代谢、糖脂代谢、维生素代谢、氧化应激、免疫、ECM等相关的代谢通路。结合iTRAQ分析、Western Blot验证及其它相关指标的检测结果发现，相比20%CP组，14%CP组显著抑制了肝脏蛋白质的生物合成，而17%CP促进了蛋白质的生物合成；低蛋白日粮（14%CP组和17%CP组）均显著抑制肝脏尿素合成，糖异生和脂肪氧化，促进了肝糖原和脂肪合成。
试验二、为分析低蛋白日粮与正常日粮组间差异miRNAs表达规律，并筛选出与尿素循环相关miRNAs，本试验采用Solexa深度测序技术分析不同蛋白日粮组猪肝脏miRNA表达谱。结果显示，共获得606条成熟体miRNAs，其中差异miRNAs为52个（包括30个上调，22个下调），且3个上调的miRNAs（ssc-miR-19b、ssc-miR-19a、hsa-miR-192-3p）在14%CP和17%CP组间表达趋势相反。经生物信息学分析发现共有15个miRNAs靶向尿素循环关键酶及其调控因子，提示这些miRNAs可能参与了调控尿素循环的过程。
试验三、通过生物信息学分析，本试验选择8个候选miRNAs并合成其相应模拟物mimics和inhibitor，转染至猪原代肝细胞，以观察其在细胞水平上尿素的合成变化。结果显示，靶向SIRT5的3个miRNAs(ssc-miR-19b、ssc-miR-145-5p、ssc-miR-204) mimics显著（P<0.05）抑制细胞外尿素含量和SIRT5/CPS1的蛋白表达；ssc-miR-19b和ssc-miR-204 inhibitor显著（P<0.05）促进尿素合成，但ssc-miR-145-5p inhibitor与mimics结果不一致。随后采用双荧光素酶报告系统验证此 miRNAs(ssc-miR-19b、ssc-miR-145-5p、ssc-miR-204)对SIRT53’-UTR的靶向作用，结果表明ssc-miR-19b能靶向SIRT5。同时，利用不同浓度氨基酸处理猪原代肝细胞，结果显示，高浓度氨基酸显著（P<0.05）增加尿素合成及SIRT5和CPS1蛋白表达量（P<0.05），采用miR-19b mimics干预后，降低了尿素含量和SIRT5和CPS1的蛋白表达量，该结果提示低蛋白日粮下，ssc-miR-19b可通过靶向SIRT5抑制其蛋白表达，进一步降低CPS1酶活从而减少尿素合成。
试验四、为验证ssc-miR-204是否通过靶向糖皮质激素受体（GR）调控尿素循环，首先通过荧光素酶双报告基因系统验证ssc-miR-204对预测靶基因GR3’-UTR的靶向作用，再以猪原代肝细胞为研究对象，采用体外合成ssc-miR-204mimic或inhibitor处理原代肝细胞（以NC或iNC为阴性对照），检测细胞内GR蛋白表达及细胞上清尿素含量等指标，用以确认 ssc-miR-204是否可通过靶向 GR3’-UTR调控尿素循环。结果显示ssc-miR-204可显著抑制荧光素酶活性（P<0.05），而缺失和突变载体的荧光素酶活性没有变化，表明ssc-miR-204与GR3’-UTR具有靶关系。转染猪原代肝细胞后发现ssc-miR-204 mimics显著降低CPS1和GR蛋白表达（P<0.05），而inhibitor却恢复了miR-204 mimics的作用。此外，通过不同浓度地塞米松处理肝细胞后采用miR-204mimics进行干预处理，结果进一步证明ssc-miR-204可通过靶向GR抑制尿素合成。同时，本试验采用不同浓度氨基酸处理肝细胞后，发现高浓度氨基酸显著增加尿素的合成、GR和CPS1的蛋白表达量（P<0.05），随后用miR-204 mimics干预后，降低了尿素含量及GR和CPS1的蛋白表达量，该结果进一步表明，低蛋白日粮情况下ssc-miR-204能通过靶向GR抑制尿素合成。
综上所述，本研究全面比较分析了低蛋白日粮与正常日粮对猪肝脏蛋白质和miRNA表达的差异，并验证了差异表达的ssc-miR-19b和ssc-miR-204可分别通过靶向SIRT5和GR抑制其相应蛋白的表达，进而下调CPS1基因表达，从而减少了尿素的合成。