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Ⅰ.水稻响应根瘤菌转录组学研究 根瘤菌不仅定殖于豆科植物根瘤中参与共生固氮,还能以内生菌形式定殖于非豆科植物中促进植物生长。目前关于根瘤菌促进非豆科植物生长的分子机制知之甚少。水稻作为重要的粮食作物,同时也是功能基因组学研究的模式植物。因此,选用水稻作为宿主植物材料,研究水稻幼苗接种根瘤菌后促生的分子机理;为后期开发根瘤菌作为生物菌肥应用于水稻实际生产提供理论依据和重要指导。主要结果如下: 1.生长特性调查。幼苗接种后第6天,其地上部分相比对照的生长量显著增加,如干重和株高分别增加30.8%和28.8%;第四叶鞘为增加量最显著的部位,其高度和干重分别增加4.2倍和3倍。根部相比于对照,增效不显著。 2.细胞学观察。通过激光共聚焦显微镜,发现接种后第2天,根瘤菌通过侧根裂缝进入根部表皮细胞;第4天进入根内部组织,包括皮层和木质部等;第5天迁移到叶鞘组织;第8天定殖在叶片维管束组织、叶肉细胞及细胞间隙。 3.组织切片学观察。幼苗接种后第8天,第四叶鞘纵切结果表明:薄壁细胞相比对照体积明显增大;横切结果表明薄壁细胞、维管束组织和通气组织细胞数目相比于对照未受影响,形状也无明显差异。 4.转录组学分析。通过比较分析幼苗接种后第1、2、5和8天与相应对照的转录组数据,共检测到2414个差异表达基因。对差异表达基因进行层次聚类表明,水稻幼苗响应根瘤菌接种的过程可以划分为早期响应事件和晚期响应事件。对差异表达基因进行基因本体(Gene Ontology)注释,共富集到43个显著功能分类。对差异基因参与的代谢通路进行富集分析,共检测到27条代谢路径,主要包括植物免疫反应、次生代谢、激素代谢、淀粉合成、细胞壁合成以及细胞周期等通路。此外,我们还发现一些差异表达转录因子,如胁迫相关转录因子MYB、 NAC、WRKY和bZIP等;激素调控相关转录因子如ARF、EIL和GRAS;细胞周期相关转录因子如CPP和E2F等共104个。以及一些差异表达激酶,如参与外界信号响应的激酶LRR、MAPK、CDPK和RLCK等,参与细胞分裂过程的CDK激酶等共74个。 5.地上部位高度和干重的促生效应和基因表达量间相关分析。地上部位干重的数据和地上部位高度的数据分别与差异表达基因的表达量进行相关性分析。结果表明,与高度相关的差异表达基因(DEGH)共有254个;与干重相关的差异表达基因(DEGw)共有368个(相关性>0.9,p<0.05)。DEGH和DEGw间没有重叠。功能注释结果表明,这些差异表达基因主要参与光合作用、碳水化合物代谢、N代谢、激素代谢、细胞周期、DNA、RNA、蛋白、脂代谢和信号转导等通路。 6.DEGw和DEGH与水稻已知数量性状位点(QTLs)的富集分析。分别检测到103和52个QTLs位点,与产量、活力、育性、品质、解剖学、发育、生物化学和生物胁迫相关。产量与活性相关的QTLs数目较多,分别占据总DEGw-QTLs的35.0%和34.0%,和总DEGH-QTLs的23.1%和32.7%。 7.qPCR表达谱分析。运用荧光定量PCR技术,分析了水稻幼苗接种根瘤菌后第1、2、5和8天,生长调控网络中关键基因的表达变化。检测的39个目的基因主要参与植物免疫,激素信号通路、细胞周期调控、淀粉积累、光合作用、细胞壁降解和次生代谢。qPCR结果进一步阐明了水稻幼苗植物免疫反应、次生代谢、转录因子以及蛋白激酶相关基因表达的变化,参与对根瘤菌信号的识别和响应;生长相关激素、光合作用、细胞周期和淀粉合成相关基因的上调表达,有利于促进水稻幼苗的生长。其中25个目的基因在芯片数据中也检测到差异表达,对其芯片数据表达值与qPCR的表达值进行相关性分析,相关性系数为r=0.936,证实了芯片数据的可靠性。 Ⅱ.构树低温响应转录因子家族分析 在2015年,构树被列入我国十项精准扶贫工程之一,实现“林-料-畜”一体化畜牧产业,充分体现了构树的经济和生态效益。而低温却成为限制构树在野外分布的一个重要因素。因此研究构树耐低温转录因子的调控机制对培育抗低温能力强的品种具有十分重要的意义。这不仅能扩大构树在野外的分布面积,也为培育具有优良特性的构树品种提供重要参考。虽然大量的研究已经在多个调控层面上集中分析了植物低温响应的耐受性,但从全基因组角度分析转录因子的分子调控网络依旧缺乏。通过转录组数据来评估低温处理下基因的表达变化,进而鉴定构树低温胁迫响应的转录因子及其调控网络。主要结果如下: 转录组学检测到794个低温胁迫反应的转录因子分属于48个家族,占总转录因子的59%以上。聚类结果表明这些转录因子被聚成三组,即早期、中期和晚期响应组,分别有95、550和149个转录因子。在这些差异表达的转录因子中,1个bHLH,2个ERFs和3个CAMTAs被认为是初始低温信号转导中关键的转录因子。之后,在低温胁迫的中间阶段,主要由两类转录因子参与生物过程的调控,即低温胁迫抗性相关的转录因子(含5个bHLHs、14个ERFs、1个HSF、4个MYBs、3个NACs和11个WRKYs等)和与横向器官或顶端分生组织生长和发育相关的转录因子(包括1个ARR-B、1个B3、5个bHLHs、2个C2H2、4个CO-like、2个ERFs、3个HD-ZIP、3个YABBYs、1个G2-like、1个GATA、1个GRAS和1个TCP)。在后期反应组中,包括3个ARR-B、1个C3H、6个CO-like、2个G2-like、2个HSFs、2个NACs和1个TCP,它们中的大多数在低温胁迫处理12或24 h后上调表达,后期响应的转录因子在构树低温胁迫后重建新的生长稳态中起重要作用。 同时,本研究确定了低温关键转录因子的级联反应网络,进而有利于挖掘构树耐受低温胁迫的下游基因。根据分析,我们发现,同其他物种一样,AP2/ERF、bHLH、MYB、NAC和WRKY家族可能在构树低温胁迫反应中发挥关键作用。与此同时,此前报道涉及生长和发育调控的转录因子家族,包括ARF、DBB、G2-like、GRF、GRAS、LBD、WOX和YAABY同样展示了它们在响应构树低温胁迫与调控生长、发育之间动态平衡的重要作用。