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AtMYB2转录因子属于MYB家族蛋白,它的表达受ABA、脱水和盐诱导,它能与TGGTTAG(反向互补序列为CTAACCA)序列结合,促进下游基因的表达。胆碱单加氧酶(CMO)是植物体内催化胆碱合成甜菜碱第一步反应过程中的关键酶,它的表达是受盐诱导的。辽宁碱蓬CMO基因启动子-267~+1bp区段(命名为pC5)是盐诱导启动子,其序列上含有AtMYB2转录因子的识别位点TAACCA。在AtMYB2/CMO-pC5双价转基因烟草体内,AtMYB2转录因子能使转基因烟草中GUS活性增加,AtMYB2转录因子在体内能与CMO启动子相互作用。本实验用原核表达的方法,纯化得到AtMYB2融合蛋白,通过EMSA实验,验证在体外AtMYB2转录因子能否与CMO基因启动子直接结合,从而分析AtMYB2转录因子对CMO基因表达的调控作用。主要内容与结果如下:
1、构建了原核表达载体pET30a-AtMYB2,并将其转化到E.BL21(DE3)菌株中,获得工程菌E.BL21-pET30a-AtMYB2。
2、AtMYB2融合蛋白可在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白既以可溶蛋白形式存在,也以包涵体形式存在。通过从IPTG浓度、诱导温度、诱导时间三方面因素优化了AtMYB2融合蛋白可溶表达的最佳条件,确定了以0.1mM IPTG诱导,30℃培养10h,可溶蛋白表达量最高。
3、利用Ni2+亲和纯化了AtMYB2可溶蛋白和6xHis载体蛋白。
4、通过凝胶阻滞分析实验验证AtMYB2蛋白与CMO基因启动子之间的相互作用,结果表明,AtMYB2转录因子能与SICMO启动子中TAACCA序列直接结合。进一步证明AtMYB2可能是调控CMO基因表达的一个转录因子