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系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种自身免疫性疾病,是以体内出现多种自身抗体(如抗Sm、抗双链DNA、抗r RNP等)、临床表现为多系统、多脏器损害为特征的弥漫性结缔组织病。目前SLE的病因和发病机制仍未明确,感染、环境、遗传等被认为是诱发其发病的主要因素。近年来越来越多的研究证实环境因素在SLE的发病机制中起着重要作用,其可影响表观遗传学机制。因此,深入探索环境因素诱发SLE发病的机制研究将为完善SLE治疗策略提供重要的理论依据。在环境因素中,人们比较关注药物和紫外线暴露。已有研究证实,环境因素(如紫外线)能够影响DNA甲基化水平。DNA甲基化是表观遗传学的主要机制,在SLE的研究中,已证实DNA甲基化与SLE疾病进展密切相关。近年来,人们试图从DNA甲基化的角度来探索研究环境因素与SLE发病及疾病进展机制之间的关系。本课题组也在这一领域较早展开系统性研究工作,首先我们发现SLE患者较健康志愿者DNA甲基化水平更低;随后将SLE患者和健康志愿者外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)给予不同剂量的中波紫外线(ultraviolet B,UVB,波长290-320 nm)照射后,研究表明紫外线暴露可以诱发SLE患者PBMC的DNA低甲基化的发生。近年来,有研究逐渐发现,mi R-410和Gadd45a与SLE的DNA甲基化有关,而本课题组也通过生物信息学软件分析发现mi R-410和Gadd45a存在潜在结合位点,提示两者间存在一定的调控关系。因此,本课题组拟在前期研究基础上,并查阅相关文献,探索紫外线暴露诱发系统性红斑狼疮患者CD4~+T细胞DNA低甲基化水平及潜在机制,以期为寻找SLE治疗的新靶点提供理论依据。第一部分紫外线照射对SLE患者CD4~+T细胞中DNA甲基化水平的影响目的探讨紫外线(UVB)照射对系统性红斑狼疮(SLE)患者CD4~+T细胞DNA甲基化水平的影响及其潜在机制。方法共收集33例SLE患者和12例健康受试者的血标本,先分离提取出CD4~+T细胞,然后给予不同剂量(0、50及100 m J/cm2)的紫外线照射。采用DNA甲基化ELISA定量试剂盒检测紫外线照射前、后各组CD4~+T细胞的DNA甲基化水平;分别通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测紫外线照射前、后各组CD4~+T细胞的DNA甲基转移酶(DNMT1和DNMT3A)的m RNA和蛋白表达水平。同时,我们还根据SLEDAI评分将SLE患者分为两组:SLE疾病活动组(n=22例,SLEDAI评分>4)和SLE稳定组(n=11例,SLEDAI评分≤4),以用于后续的亚组分析。结果在基线水平,与健康对照组相比,SLE患者CD4~+T细胞的DNA甲基化水平和DNMT3A m RNA水平明显降低;而在接受不同剂量的紫外线照射(0、50和100 m J/cm2)后,三个亚组中CD4~+T细胞的DNA甲基化水平均以剂量依赖性方式降低;同时我们还发现,SLE疾病活动组CD4~+T细胞经100 m J/cm2的紫外线照射后,其DNA甲基化水平和DNMT3A m RNA水平的减少更加明显。另外结果还发现,紫外线照射对其中的DNMT1 m RNA和蛋白表达水平以及DNMT3A蛋白表达水平并无显著影响。结论紫外线照射可显著降低SLE患者CD4~+T细胞的DNA甲基化水平,其机制可能与抑制DNMT3A m RNA水平有关,该结论仍需未来进一步实验验证。第二部分MiR-410调控Gadd45a参与UVB暴露诱发SLE患者CD4~+T细胞DNA低甲基化的机制研究目的在本实验第一部分发现UVB照射后可引起SLE患者CD4~+T细胞DNA甲基化水平降低的基础上,继续深入探索其可能与mi R-410和Gadd45a相关的潜在机制。方法继续收集20例SLE患者和10例健康受试者的血标本,先分离提纯出CD4~+T细胞,然后给予不同剂量(0、50及100 m J/cm2)的紫外线照射。采用DNA甲基化ELISA定量试剂盒检测紫外线照射前、后各组CD4~+T细胞的DNA甲基化水平;采用实时荧光定量PCR法检测紫外线照射前、后各组CD4~+T细胞的mi R-410及Gadd45a m RNA水平;蛋白印迹法检测Gadd45a的蛋白水平表达;通过双荧光素酶报告基因法分析mi R-410和Gadd45a之间的调控关系;运用基因转染的方法使SLE患者CD4~+T细胞mi R-410过表达,检测其对紫外线照射后DNA甲基化及Gadd45a表达的影响。结果在基线水平,与健康对照组相比,SLE患者CD4~+T细胞的DNA甲基化和mi R-410水平显著降低,Gadd45a水平显著升高;而在接受不同剂量(0、50及100 m J/cm2)的紫外线照射后,SLE患者CD4~+T细胞的DNA甲基化和mi R-410水平均显著降低,Gadd45a水平显著升高,且均呈紫外线剂量依赖性方式发生变化,尤以100 m J/cm2的剂量改变最显著;双荧光素酶报告基因法证实mi R-410负向调控Gadd45a的表达;上调mi R-410表达后,可相应下调Gadd45的表达水平,最终部分逆转因紫外线暴露引起的DNA低甲基化。结论MiR-410可负向调控Gadd45a参与紫外线暴露引起的SLE患者CD4~+T细胞DNA的低甲基化。