LncRNA028466在细粒棘球绦虫抗原P29诱导小鼠免疫中对脾淋巴细胞因子表达调控的初步研究

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目的初步探讨长链非编码RNA 028466(lncRNA 028466)在细粒棘球绦虫抗原P29(rP29)诱导小鼠产生免疫过程中对CD4~+T淋巴细胞Th1和Th2细胞因子表达的调控作用,为lncRNA在寄生虫调控作用的深入研究积累资料。方法1.纯化和鉴定rP29:用亲和层析法纯化基因工程菌株诱导表达的rP29,用Western Blot鉴定。2.建立rP29小鼠免疫模型并制备各组的淋巴细胞:6-8 w雌性BALB/c小鼠24只,随机分为2组(对照组和免疫组),每组12只,对照组不做处理,免疫组注射10μg蛋白与等体积弗氏完全佐剂的乳化剂,初次免疫后2 w,相同剂量加强免疫,加强免疫用弗氏不完全佐剂,两次免疫均是腹部皮下3点注射,总剂量100μl/只,第二次免疫后2w,无菌环境制备脾细胞悬液,分离各组淋巴细胞备用。3.验证lncRNA028466在脾淋巴细胞中的相对表达量:(1)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA028466在脾淋巴细胞中的相对表达量。(2)流式细胞术分选脾淋巴细胞亚群CD4~+T、CD8~+T和B细胞。(3)qRT-PCR检测lncRNA 028466在各淋巴亚群细胞中的相对表达量。4.构建lncRNA028466慢病毒过表达载体干预Naive CD4~+T细胞:(1)用293T细胞包装慢病毒获得lncRNA028466慢病毒过表达载体,转染Naive CD4~+T细胞,分为过表达组(pCDH-028466组)和对照组(vector组),通过qRT-PCR检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10 mRNA表达情况。(2)通过流式细胞术检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10胞内表达情况。(3)通过ELISA检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10上清分泌情况。5.合成siRNA028466干预Naive CD4~+T细胞:(1)由试剂公司合成siRNA028466干扰片段:siRNA1、siRNA2和siRNA3,分别转染Naive CD4~+T细胞,分为干扰组1(siRNA1组)、干扰组2(siRNA2组)、干扰组3(siRNA3组)和阴性对照组(negative组),通过qRT-PCR验证三个片段的干扰效果。(2)用干扰效果较好的siRNA1转染Naive CD4~+T细胞,通过qRT-PCR检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10 mRNA表达情况。(3)通过流式细胞术检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10胞内表达情况。(4)通过ELISA检测细胞因子IL-2,IFN-γ,IL-4和IL-10上清分泌情况。结果1.用亲和层析法纯化基因工程菌株诱导表达的rP29蛋白相对分子质量(Mr)约31000。2.验证lncRNA028466在脾淋巴细胞中的相对表达量:(1)qRT-PCR结果显示,lncRNA028466在免疫组淋巴细胞中的相对表达量明显低于对照组(P<0.0001)。(2)流式细胞术分选脾淋巴细胞亚群CD4~+T、CD8~+T和B细胞所占比例分别为:对照组21.6%、7.1%和56.7%,免疫组26%、8.0%和56.0%。(3)qRT-PCR结果显示,lncRNA028466在免疫组CD4~+T淋巴细胞中的相对表达量明显低于对照组(P<0.01),lncRNA028466在CD8~+T和B淋巴细胞中的表达没有统计学意义(P>0.05)。3.构建lncRNA028466慢病毒过表达载体干预Naive CD4~+T细胞:(1)qRT-PCR结果显示,pCDH-028466组中IFN-γ和IL-2 mRNA的相对表达低于vector组(P<0.001,P<0.001),而pCDH-028466组中IL-4和IL-10 mRNA相对表达量高于vector组(均P<0.01)。(2)流式细胞术检测结果显示,pCDH-028466组中IFN-γ和IL-2表达低于vector组(均P<0.05),而IL-10和IL-4在pCDH-028466组表达高于vector组(均P<0.05)。(3)ELISA结果显示,pCDH-028466组IFN-γ和IL-2水平低于vector组(P<0.01,P<0.0001),pCDH-028466组IL-4和IL-10水平高于vector组(P<0.001,P<0.05)。4.合成siRNA028466干预Naive CD4+T细胞:(1)qRT-PCR结果显示,干扰片段1(siRNA1)组中lnc RNA028466的相对表达明显低于negative组(P<0.0001),而干扰片段2(siRNA2)组和干扰片段3(siRNA3)组与negative组比较没有统计学意义(P>0.05),说明siRNA1干扰效果较好,siRNA2和siRNA3无干扰作用,所以后续实验都采用siRNA1进行干预。(2)qRT-PCR结果显示,siRNA1组中IFN-γ和IL-4 m RNA的相对表达与negative组比较没有统计学意义(P>0.05),IL-2 m RNA的相对表达量高于negative组(P<0.001),而IL-10 m RNA相对表达量低于negative组(P<0.001)。(3)流式细胞术结果显示,IFN-γ和IL-2在siRNA1组中的表达高于negative组(均P<0.05,P<0.01),而IL-4和IL-10在siRNA1组中表达低于negative组(均P<0.05)。(4)ELISA结果显示,IFN-γ和IL-4在siRNA1组和negative组中无显著差异,没有统计学意义(P>0.05),siRNA1组中IL-2水平高于negative组(P<0.05),而IL-10水平低于negative组(P<0.0001)。结论lncRNA028466在rP29免疫组CD4+T细胞中显著下调,过表达lncRNA028466可以抑制Th1相关的细胞因子IL-2和IFN-γ的表达,而沉默lnc RNA028466促进Th1细胞因子IL-2的表达,抑制Th2相关的细胞因子IL-10的表达促进Th2相关的细胞因子IL-4和IL-10的表达,因此,lnc RNA028466可能通过调控初始CD4+T细胞Th1和Th2细胞因子的表达参与P29诱导宿主产生免疫保护过程。
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