论文部分内容阅读
第一部分小鼠移植物血管病变模型的建立以及PCSK9表达分析目的:比较当前常用的3种不同血管吻合方式,在构建小鼠移植物血管病变模型上的差异,选出最适的方式构建小鼠移植物血管病变模型,明确PCSK9在小鼠移植物血管病变模型中的表达。方法:1.将雄性C57Bl/6（H-2b）与BALB/c（H-2d）小鼠作为供体,无菌环境下分离腹主动脉,采用端端吻合法、袖套法和套管缝合法与受体C57Bl/6（H-2b）雄性小鼠的腹主动脉进行原位吻合。2.记录血管移植手术相关参数:小鼠体重、小鼠主动脉直径、受体动脉准备的时间、动脉吻合时间和总手术时间,持续观察术后小鼠肢体活动8周。3.在术后第八周收集移植血管进行HE和Masson染色。4.在无菌条件下,采用袖套缝合法构建小鼠移植物血管病变模型,在移植术后第8周收集受体小鼠血清、移植血管、肝脏、小肠、肾脏等样本进行PCSK9表达水平的检测。运用ELASA检测血清中PCSK9含量,并用WB和IHC分析受体小鼠移植血管、肝脏、肾脏、小肠中PCSK9的表达水平。结果:1.三种血管吻合方式均能成功构建小鼠移植物血管病变模型,且不同血管缝合方式移植血管病理严重程度没有差异,其中袖套法血管吻合时间和总的手术时间最短。此外,袖套法和套管缝合法相比端对端吻合法具有更小的出血量。且在三种缝合技术中,袖套法手术成功率最高。因此,我们认为袖套法吻合血管相比于端端吻合法和套管缝合法更适应于小鼠移植物血管病变模型的构建。2.采用袖套法构建小鼠移植物血管病变模型,移植术后第8周进行血清PCSK9的ELISA检测发现同种异体移植组血清中PCSK9含量相比同系移植的增高,同时收集受体小鼠中的移植血管、肝脏、肾脏、小肠进行PCSK9蛋白表达分析发现:在同种异体移植小鼠中,移植血管和肝脏中PCSK9表达增高。上述结果提示,PCSK9可能参与小鼠移植物血管病变的狭窄。结论:1.袖套吻合血管优于端端吻合法和套管吻合,更适用于小鼠移植物血管病变模型构建。2.在移植物血管病变模型中,PCSK9在循环血液、移植血管局部、肝脏表达增高,提示其可能参与移植物血管病变。第二部分PCSK9在小鼠移植物血管病变模型中的作用及机制研究目的:探讨PCSK9在小鼠移植物血管病变模型中的作用及机制。方法:1.在无菌环境下,游离BALB/c（H-2d）小鼠的腹主动脉,分别移植到雄性Pcsk9基因敲除小鼠和野生型雄性C57Bl/6（H-2b）小鼠。在移植术后第2周,用IHC检测移植血管部位巨噬细胞和T细胞的浸润情况,用RT-q PCR检测移植血管局部炎症相关基因的表达。2.在术后第8周收集移植血管进行HE,EVG和Masson染色,明确Pcsk9基因敲除对于移植血管病理改变的影响。3.用移植术后的血清刺激来自WT小鼠和Pcsk9-/-小鼠的BMDMs和VSMCs,用Transwell实验检测细胞的迁移,用Edu和WB检测细胞的增殖能力。4.用移植术后的血清刺激来自WT小鼠和Pcsk9-/-小鼠的VSMCs,用蛋白印迹检测MEK通路、TGF-β/Smad3、NLRP3炎症小体通路的改变。用蛋白免疫印迹和免疫组化手段验证体内信号通路的改变。结果:1.Pcsk9-/-组移植血管病变中F4/80+巨噬细胞相比WT组中浸润明显减少,而CD3+T细胞浸润在这两组中无明显差异,Pcsk9-/-组移植血管病变中Il1b、Il6、Il18、Ifng、Tgfb、Ccl2、Vcam1的m RNA表达低于WT组。2.Pcsk9-/-组移植血管I/M比值,新生内膜面积,胶原纤维的沉积明显低于WT组。3.Pcsk9-/-BMDMs与WT BMDMs在细胞迁移数量和Edu阳性细胞数量方面没有差异,而Pcsk9-/-VSMCs在细胞迁移数量和Edu阳性细胞数量要低于WT VSMCs。4.Pcsk9-/-VSMCs与WT VSMCs在MEK信号通路,TGF-b/Smad3信号通路活化程度上没有差异,而在NLRP3炎症小体通路中,Pcsk9-/-VSMCs中NLRP3小体的活化程度低于WT VSMCs。在移植血管局部,用WB和IHC检测显示:Pcsk9-/-组小鼠移植血管中NLRP3和IL-1β的蛋白表达低于WT小鼠。结论:1.Pcsk9基因敲除可以减少移植血管局部巨噬细胞募集和炎症因子的表达,抑制移植血管新生内膜的形成和胶原纤维的沉积。2.Pcsk9基因敲除抑制了血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力。3.Pcsk9基因敲除抑制平滑肌细胞中NLRP3炎症小体通路的活化。第三部分PCSK9抑制剂对人源化PCSK9小鼠移植物血管病变模型的影响目的:探究PCSK9抑制剂（Evolocumab）对人源化PCSK9小鼠移植物血管病变模型中的作用方法:1.将雄性C57Bl/6（H-2b）与BALB/c（H-2d）小鼠作为供体,无菌环境下分离腹主动脉,移植到人源化Pcsk9转基因小鼠。在术后,每2周给受体小鼠皮下注射Evolocumab（10mg/kg）或Ig G,在术后第8周获取各组肝脏组织,通过WB和IF分析肝脏组织低密度脂蛋白受体（LDLR）的表达。2.同时在术后第8周获取各组移植血管进行HE、EVG和Masson染色,明确PCSK9抑制剂对人源化PCSK9小鼠移植血管病理的影响。结果:1.PCSK9抑制剂（Evolocumab）注射组肝脏LDLR的表达高于Ig G组和同系移植组。2.PCSK9抑制剂（Evolocumab）注射组血管I/M比值,新生内膜面积,胶原纤维的沉积明显低于Ig G组。结论:PCSK9抑制剂（Evolocumab）能够在人源化PCSK9小鼠中发挥作用,抑制肝脏LDLR的降解,改善移植物血管病变。