1大鼠膈肌细胞质膜上HWTX-Ⅰ作用受体的纯化与鉴定　　 虎纹捕鸟蜘蛛[Selenocosmia(=ornithoctonus)huwena]是不久前鉴定的一个蜘蛛新种，分布在我国南部云南和广西部分山区。它的粗毒中含有多种活性成分，其中研究得较为深入的主要是多肽神经毒素。虎纹捕鸟蜘蛛毒素-Ⅰ(Huwentoxin-Ⅰ，HWTX-Ⅰ)是虎纹捕鸟蜘蛛粗毒中含量最高的一种多肽神经毒素。它由33个氨基酸残基组成，由6个Cys形成3对二硫键。膜片钳分析提示它是一种N型钙离子通道阻断剂，能可逆性阻断小鼠膈神经膈肌标本神经肌肉接头的传递，作用位点在突触前膜。　　 为了对HWTX-Ⅰ在膈肌细胞质膜上的受体蛋白进行分离纯化和鉴定，获得有关HWTX-Ⅰ作用机理的更直接的证据，本研究首先对HWTX-Ⅰ进行了生物素标记，然后利用基于生物素-亲和素系统的亲和纯化和化学交联两种方法对HWTX-Ⅰ在大鼠膈神经-膈肌突触细胞质膜上的受体蛋白进行了分离纯化与鉴定。亲和纯化出来的受体蛋白组分经超滤脱盐、胰蛋白酶溶液酶解和质谱分析后，我们鉴定到了几种HWTX-Ⅰ的可能受体。同时，我们用化学交联和Western blotting的方法在膜蛋白分子量50-80 kD的范围内定性的检测到了膈肌细胞质膜上HWTX-Ⅰ的受体的存在。对这个分子量范围的蛋白质进行胰蛋白酶酶解和质谱分析后，也鉴定到了几种HWTX-Ⅰ的可能受体。　　 2基于胶包埋的膜蛋白样品的制备及其质谱分析　　 膜蛋白是重要的生物学和药理学的靶点，与细胞间的通讯，囊泡运输，离子转运，蛋白易位/整合和信号级联放大等密切相关。现代基因组分析表明所有开放阅读框的20-30％编码膜蛋白。对膜蛋白尤其是整合膜蛋白进行全面、高通量的分析将会有利于我们了解它们在细胞生命活动中的作用。然而，由于这些蛋白质大多具有疏水性强和丰度低的特性，使得对它们的研究成为具有挑战性的课题。为了增强膜蛋白的溶解性，人们通常采用含有机溶剂或去污剂的缓冲液提取这些蛋白质。然而，虽然这些添加剂能够促进蛋白质的溶解，进而提高其提取效率，但这些添加剂的浓度较高时大多会在后续的酶解过程中降低蛋白酶的活性并干扰后续的质谱分析。因此，如何将这些添加剂从膜蛋白样品中除去就成为一个值得探讨的课题。　　 本研究中，我们发展了一种适合膜蛋白质谱分析的样品制备新方法，包括蛋白质的热凝胶包埋和改进型胶内酶解。在这种方法中，用含有高浓度SDS的缓冲液提取膜蛋白，然后将含去污剂的膜蛋白溶液与丙烯酰胺溶液混合，当胶聚合时蛋白质就被包埋和固定于胶块之中。为了探讨温度对蛋白质包埋的影响，蛋白质包埋在不同的温度(25℃，35℃，45℃)下进行。用重复洗涤的方法将SDS从胶块去除后，胶内酶解分别在0.1％ALS,0.1％SDC,10％ACN中进行。萃取收集酶解肽段后经CapLC-MS/MS分析。研究结果表明，与25℃下的凝胶包埋相比，45℃下的热凝胶包埋能够提高蛋白质的包埋效率和鉴定效果，鉴定的整合膜蛋白增加了27％。就促进胶包埋的膜蛋白尤其是疏水性整合膜蛋白的胶内酶解和提高肽段回收率方面而言，0.1％SDC比0.1％ALS和10％ACN更为有效。通过热凝胶包埋结合改进型胶内酶解的策略鉴定到的326个整合膜蛋白中，有149(46％)个蛋白质至少具有2个跨膜区。这些结果表明，我们发展的新方法可促进膜蛋白尤其是整合膜蛋白的高通量分析。