背景与目的:孕激素(Progesterone,P)在胚胎发育成熟和着床过程中起重要作用,孕激素不足可导致胚胎发育不良,及妊娠终止引起流产。孕激素通过调节与着床有关分子的表达促进胚胎的增殖和黏附能力。多种病理和生理过程受到蛋白质糖基化的影响,其中包括了胚胎发育与着床过程。O-糖基化和N-糖基化是蛋白质糖基化的主要形式。蛋白质的O-岩藻糖基化受蛋白质O-岩藻糖基转移酶(po FUTs,protein-fucosyltransferases)的催化,而po FUTs在促进胚胎发育与着床过程中的作用未见报道。激活蛋白-1(AP-1)是一种转录因子,转录因子家族由Jun和Fos的细胞同源物组成,参与细胞增殖、分化、和侵袭过程和内分泌基因的调节。研究发现,AP-1(c-Jun/c-Fos)广泛表达于人胎盘中,活化的AP-1具有调控胎盘的形成和胎儿发育的作用。本研究拟探讨孕激素对蛋白质O-岩藻糖基化的调控作用及影响胚胎增殖和着床过程。研究结果表明JAR细胞经孕激素作用,增加AP-1(c-Jun/c-Fos)的磷酸化表达,上调poFUT1的基因表达,并促进胚胎细胞的黏附能力与增殖能力。实验有助于揭示岩藻糖在着床糖生殖生物学中的作用及其机制,为临床医学提供研究及诊断治疗的新思路。方法:1.利用ELISA和Western blot检测健康未孕、早孕和流产妇女血清中孕激素和poFUT1的蛋白表达水平。通过免疫荧光的方法验证人绒毛组织中poFUT1的定位和表达。2.利用Western blot,免疫荧光和Real-time PCR等方法,观察孕激素对胚胎滋养层细胞中poFUT1基因和蛋白表达水平的影响,以及孕激素与米非司酮联合应用对poFUT1基因和蛋白表达水平的影响。3.利用Western blot,免疫荧光和Real-time PCR等方法,观察孕激素影响poFUT1的表达及对细胞增殖黏附功能的改变。4.为了探讨孕激素是如何调控poFUT1表达,我们采用Western blot、EMSA和免疫荧光方法确定孕激素可激活转录因子AP-1的转录活性。5.利用染色质免疫沉淀技术检测转录因子AP-1直接作用在poFUT1的启动子区域,促进poFUT1转录,并且通过Western blot和Real-time PCR检测瞬时转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒和AP-1抑制剂(TIIA)处理后poFUT1基因和蛋白表达的变化。6.体外着床模型是在荧光显微镜下,观察和统计黏附率,检测了包括正常组、孕激素组、孕激素联合米非司酮组、转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒组,AP-1抑制剂(TIIA)组以及分别联合孕激素等9组的胚胎黏附率。并且利用Western blot、免疫荧光和CCK-8检测JAR细胞增殖能力。结果:1.收集临床样品包括健康未孕、正常早孕和先兆流产女性血清进行ELISA检测发现:正常早孕妇女血清中,孕激素和poFUT1的含量均高于先兆流产患者和健康未孕的女性;而先兆流产患者血清中,孕激素和poFUT1的含量比早孕妇女低。孕激素和poFUT1在血清中的表达变化呈正相关。通过免疫荧光确定人早孕绒毛中poFUT1的定位和表达。2.孕激素促进poFUT1的基因和蛋白水平的表达。经过不同浓度的孕激素和不同作用时间处理后,通过Real-time PCR和Western blot等方法检测发现,孕激素能显著促进JAR细胞poFUT1基因和蛋白的表达;Real-time PCR、Western blot和免疫荧光结果表明,联合应用米非司酮(RU486)可抑制孕激素的效用;瞬时转染poFUT1 siRNA后,poFUT1表达明显降低,联合孕激素处理后可回调poFUT1的表达。3.孕激素促进poFUT1的表达并调节JAR细胞的增殖与黏附的能力。Real-time PCR、Western blot和免疫荧光结果发现,干扰poFUT1的JAR细胞中合并应用孕激素可以恢复poFUT1的表达。通过Western blot、CCK-8和免疫荧光等方法分析发现孕激素调控poFUT1的表达影响JAR细胞的增殖和黏附能力。4.孕激素激活转录因子AP-1的转录活性。Western blot、EMSA和免疫荧光结果发现,孕激素(10-5mol/L)可上调转录因子AP-1(c-Jun/c-Fos)的表达水平,并促进其在核中的积累。5.AP-1直接影响靶基因poFUT1的转录,Real-time PCR、Western blot结果显示,与对照组相比,抑制了AP-1的转录激活能力可降低poFUT1的表达水平。通过CHIP实验进一步确定了AP-1直接作用在poFUT1启动子区域,引起下游靶基因poFUT1转录并调控其表达变化。6.孕激素通过激活转录因子AP-1上调poFUT1表达水平。孕激素可调控poFUT1的表达,poFUT1的表达变化可影响胚胎细胞增殖能力。通过Western blot、CCK-8和免疫荧光分析发现,与对照组相比,孕激素能提高JAR细胞的增殖能力;c-Jun/c-Fos siRNA能降低JAR细胞的增殖能力;联合孕激素处理可一定程度的回调由c-Jun/c-Fos siRNA引起JAR细胞增殖能力降低的现象;同时,孕激素也能够回调由AP-1抑制剂(TIIA)引起JAR细胞低的增殖能力;研究发现,孕激素可提高胚胎细胞的增殖能力。7.利用体外黏附模型,观察胚胎细胞的体外黏附率。孕激素可提高JAR细胞的黏附率;瞬时转染c-Jun/c-Fos siRNA干扰质粒可降低JAR细胞的黏附率;同时,孕激素能够恢复c-Jun/c-Fos siRNA预处理的JAR细胞的低黏附率;孕激素也能够恢复预处理AP-1抑制剂TIIA的JAR细胞低黏附率;进一步的研究发现孕激素可恢复poFUT1 siRNA导致的胚胎较低的黏附率。孕激素通过促进poFUT1的表达提高了胚胎的黏附能力。结论:1.正常早孕时期女性血清中孕激素和poFUT1的含量较先兆流产患者高,且呈正相关性。人绒毛组织上有poFUT1的表达。2.孕激素促进poFUT1基因与蛋白的表达水平。3.孕激素激活转录因子AP-1(c-Jun/c-Fos),并上调poFUT1的表达。4.孕激素促进胚胎细胞增殖能力。5.孕激素通过激活转录因子AP-1(c-Jun/c-Fos)的转录活性,进而调控靶基因poFUT1的转录,促进胚胎细胞与子宫内膜细胞的黏附。